[發明專利]一種NAC2基因mRNA在葫蘆科砧穗間運輸的分子鑒定方法

在審

• 申請號: 202010325101.1
• 申請日: 2020-04-23
• 公開（公告）號: CN111593056A
• 公開（公告）日: 2020-08-28
• 發明（設計）人: 張文娜;李曉軍
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京衛平智業專利代理事務所(普通合伙) 11392
• 代理人: 張新利;謝建玲

1.一種黃瓜NAC2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如權利要求1所述黃瓜NAC2基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一種NAC2基因mRNA在葫蘆科砧穗間運輸的分子鑒定方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)黃瓜與南瓜分別進行自嫁接；以黃瓜為接穗，南瓜為砧木進行嫁接；以南瓜為接穗，黃瓜為砧木進行嫁接，嫁接方式均為下胚軸嫁接；

(2)分析所述黃瓜NAC2基因的核苷酸序列，尋找與南瓜同源基因的差異片段，設計黃瓜NAC2基因的特異性引物，保證以黃瓜cDNA為模板時可以擴增得到條帶，以南瓜cDNA為模板時無法擴增，電泳不產生條帶；

(3)將嫁接植株分為兩組，一組低溫處理，另一組適溫生長；每組都包含黃瓜、南瓜自嫁接以及異嫁接植株，提取嫁接成活后的砧木和接穗的RNA，反轉錄成cDNA，PCR擴增黃瓜NAC2的基因片段；

(4)凝膠電泳檢測是否有正確的電泳條帶：如果在嫁接體系中存在RNA的傳遞，則在砧木的擴增產物中會出現接穗的特異性條帶，同樣在接穗的擴增產物中也會出現砧木的特異性條帶；如果不發生傳遞，那么擴增產物的電泳圖中就會顯示出各自相應樣品的條帶而無其他雜帶。

4.如權利要求3所述的NAC2基因mRNA在葫蘆科砧穗間運輸的分子鑒定方法，其特征在于：步驟(1)具體過程包括：

1)接穗、砧木的培育：將砧木和接穗種子分別進行育苗，待接穗長至一葉一心，砧木子葉完全展開，砧木和接穗的下胚軸粗度保持一致；

2)下胚軸嫁接：用刀片將接穗子葉下方1cm處斜向下切出30°斜面，去除砧木的全部子葉，用刀片在砧木子葉下方1cm處斜切一刀，切面長度與接穗的斜面長度一致，然后將接穗與砧木切面對齊貼緊并用嫁接夾固定；然后將砧木子葉部分嫁接至原接穗切面處，用嫁接夾固定住嫁接口處；

3)嫁接后管理：將嫁接苗放置育苗套裝中，透明塑料頂罩上用噴壺充分濕潤，育苗基質澆透水，保持育苗套裝內小環境的濕度；將育苗套裝用保鮮膜密封后放入28±2℃培養箱中暗培養2-3d，后轉入弱光培養3-4d，之后進行正常光照培養。

5.如權利要求3所述的NAC2基因mRNA在葫蘆科砧穗間運輸的分子鑒定方法，其特征在于：步驟(2)中設計的特異性引物序列為：

上游引物5‘-CTCCGTCCCCAGAATGCACA-3’

下游引物5‘-CAAATGGAACGTCCTCTGGCATA-3’。

6.如權利要求3所述的NAC2基因mRNA在葫蘆科砧穗間運輸的分子鑒定方法，其特征在于：步驟(3)中分別提取低溫處理和適溫生長的嫁接植株的兩葉一心時期的根和第一真葉的RNA進行反轉錄。

7.如權利要求3所述的NAC2基因mRNA在葫蘆科砧穗間運輸的分子鑒定方法，其特征在于：步驟(3)中PCR擴增反應程序如下：

95℃預變性3min；

95℃30s；

60℃30s；

72℃1min；

39個循環；

72℃最后延伸5min。

8.如權利要求3-7任一權利要求所述的分子鑒定方法在葫蘆科植物砧穗間NAC2 mRNA分子傳遞的鑒定上的應用。