[發(fā)明專利]一種含泥土檢材中微量DNA的提取方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010324464.3
• 申請(qǐng)日: 2020-04-22
• 公開（公告）號(hào): CN111394427B
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 車鑫;王占海;魯斌;李軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧波市博坤生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806
• 代理公司: 吉林大華銘仁律師事務(wù)所 22208
• 代理人: 申基成

本發(fā)明公開了一種含泥土檢材中微量DNA的提取方法，包括如下步驟：(1)將含泥土檢材放入離心管中，加入裂解液進(jìn)行90?100℃裂解處理，離心后得到上清液；(2)加入羧酸基陽離子樹脂，混勻后60?90℃金屬浴加熱處理，離心后吸取上清液；(3)加入吸附液、磁珠懸濁液，混勻，磁吸后吸棄所有液體；(4)向離心管中加入洗滌液Ⅰ，洗滌，磁吸，棄上清，之后使用洗滌液II重復(fù)上述操作，再使用洗滌液III重復(fù)上述操作；(5)離心管徹底干燥后，加入高純水震蕩混勻，65℃金屬浴溫浴10分鐘，混勻，磁吸后得到DNA溶液。本方法可以有效地從含泥土檢材中提取微量DNA，靈敏度高、抗雜質(zhì)干擾能力強(qiáng)、檢出率高，應(yīng)用前景廣闊。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種含泥土檢材中微量DNA的提取方法。

背景技術(shù)

DNA檢驗(yàn)技術(shù)是目前法醫(yī)檢驗(yàn)技術(shù)的重要組成，通過對(duì)案件現(xiàn)場采集的DNA樣本進(jìn)行測序分析，短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)分型是法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定的主要技術(shù)手段。目前，法醫(yī)DNA檢驗(yàn)包含DNA樣本的采集、DNA提取和純化、PCR擴(kuò)增和分型檢測等步驟，其中微量DNA的提取和純化是后續(xù)檢驗(yàn)的前提，對(duì)能否獲得有效STR分型起到至關(guān)重要的作用。

目前各種常用的DNA純化方法可分成兩類：液相純化和固相純化。液相純化法包括有機(jī)試劑提取法、Chelex-100法等，有機(jī)試劑提取法步驟繁瑣、耗時(shí)、檢材易污染。Chelex-100法不足的是提取的DNA純化不高，易受檢材泥土中的金屬離子、深色燃料等PCR抑制物的干擾。近年來，DNA固相提取方法發(fā)展迅速，在DNA提取領(lǐng)域占有非常重要的地位。這類方法一般需要四個(gè)主要步驟：1、裂解細(xì)胞使細(xì)胞膜、核膜破裂以釋放DNA；2、釋放的DNA與固相載體結(jié)合；3、通過洗滌去除雜質(zhì)；4、洗脫得到純化的DNA?，F(xiàn)已開發(fā)了多種固相載體，如二氧化硅微球、薄膜過濾器、金屬氧化物、膠乳沉淀、硅藻土、玻璃粉等。當(dāng)DNA存在于在高濃度離液鹽以及低pH值溶液中，能夠吸附到固相載體介質(zhì)表面，并在低鹽溶液中洗脫下來，進(jìn)而達(dá)到純化的目的。

含泥土檢材中微量DNA提取純化的一大難點(diǎn)就是DNA含量低，業(yè)內(nèi)公認(rèn)檢材中微量DNA含量在0.1-0.25ng之間。泥土雜質(zhì)表面具有可與DNA中磷酸基團(tuán)相作用的位點(diǎn)，對(duì)DNA具有吸附性，可與DNA固相載體競爭吸附DNA，這使得含量本就很低的DNA更加難以提取純化；同時(shí)由于案發(fā)現(xiàn)場環(huán)境的復(fù)雜性，從現(xiàn)場采集的含泥土檢材中不可避免的會(huì)存在一些金屬離子、腐植酸等抑制劑，如不能在提取環(huán)節(jié)進(jìn)行有效純化，則會(huì)對(duì)后續(xù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生影響，這進(jìn)一步增加了含泥土檢材中微量DNA的提取純化難度，而這些檢材在案件偵破中往往是至關(guān)重要的證據(jù)來源。隨著法醫(yī)DNA技術(shù)的發(fā)展，對(duì)該類檢材中DNA提取純化的需求越來越多，無法有效對(duì)其進(jìn)行DNA提取純化會(huì)直接導(dǎo)致該類檢材DNA檢出率很低，無法滿足日益增長的案件檢驗(yàn)需求。

針對(duì)以上情況，有必要開發(fā)一種可以從含泥土檢材中提取微量DNA的有效方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種含泥土檢材中微量DNA的提取方法，其能夠更好地解決微量、疑難生物檢材DNA的提取和富集，靈敏度高、抗雜質(zhì)干擾能力強(qiáng)、檢出率高，應(yīng)用前景廣闊。

為達(dá)到以上目的，本發(fā)明提供了一種含泥土檢材中微量DNA的提取方法，包括以下步驟：

(1)裂解：將20mg含泥土檢材放入離心管中，加入200-400μL裂解液，90-100℃金屬浴裂解5-15分鐘，10000-12000rpm離心2-4分鐘后吸取上清液至另一個(gè)離心管中，所述裂解液包括3.0-7.0mol/L異硫氰酸胍、10-40mmol/L?Tris-HCl、5-15mmol/L吐溫80、2-5mmol/LEDTA和0.05-0.5mmol/L氨基磷酸酯衍生物，所述裂解液用1mol/L?NaOH溶液將pH值調(diào)至7.5-8.5；

(2)向步驟(1)得到的上清液中加入10-20mg羧酸基陽離子樹脂，混勻后，60-90℃金屬浴10-20分鐘，7000-10000rpm離心2-4分鐘，吸取上清液轉(zhuǎn)到另一個(gè)離心管中；