[發明專利]一種含泥土檢材中微量DNA的提取方法

有效

• 申請號: 202010324464.3
• 申請日: 2020-04-22
• 公開（公告）號: CN111394427B
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 車鑫;王占海;魯斌;李軍
• 申請（專利權）人: 寧波市博坤生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 吉林大華銘仁律師事務所 22208
• 代理人: 申基成

1.一種含泥土檢材中微量DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）裂解：將20mg含泥土檢材放入離心管中，加入200-400?μL裂解液，90-100℃金屬浴裂解5-15分鐘，10000-12000rpm離心2-4分鐘后吸取上清液至另一個離心管中，所述裂解液包括3.0-7.0?mol/L異硫氰酸胍、10-40?mmol/L?Tris-HCl、5-15?mmol/L?吐溫80、2-5mmol/L?EDTA和0.05-0.5?mmol/L氨基磷酸酯衍生物，所述裂解液用1?mol/L?NaOH溶液將pH值調至7.5-8.5；

（2）向步驟（1）得到的上清液中加入10-20?mg羧酸基陽離子樹脂，混勻后，60-90℃金屬浴10-20分鐘，7000-10000rpm離心2-4分鐘，吸取上清液轉到另一個離心管中；

（3）DNA吸附：向步驟（2）得到的上清液中加入300-600?μL吸附液和10-20?μL磁珠懸濁液，混勻，磁吸1分鐘，吸棄所有液體，所述吸附液包括2.0-5.0?mol/L鹽酸胍、10-40?mmol/LTris-HCl和1.5-2.5?mol/L乙二醇，并且所述吸附液通過醋酸-醋酸鈉緩沖溶液將pH值調至3-4之間，所述磁珠懸濁液包含分散在高純水中質量百分比濃度為9%的、尺寸為100-2000nm的二氧化硅磁性復合微粒，所述二氧化硅磁性復合微粒是由兩個或更多個鐵氧體-二氧化硅核殼納米粒子交聯而成的交聯體，并且微粒表面具有多個納米級尺寸的突起；

（4）洗滌：向離心管中加入200-400?μL洗滌液I，混勻，磁吸1分鐘，吸棄所有液體，之后使用800-1000?μL洗滌液II重復上述操作，然后再使用600-800?μL洗滌液III重復上述操作，

所述洗滌液I包括2.0-5.0?mol/L異硫氰酸胍、10-30?mmol/L?Tris-HCl和1.5-2.5mol/L乙二醇；

所述洗滌液II包括終濃度為2.0?mol/L的氯化鈉、體積百分比為50%的無水乙醇、體積百分比為20%的異丙醇和體積百分比為30%的水；

所述洗滌液III包括體積百分比為50%的無水乙醇和體積百分比為50%的異丙醇；

（5）洗脫：離心管開蓋置于65℃金屬浴5-10分鐘，內容物徹底干燥后，加入10-100?μL的高純水，混勻，65℃金屬浴閉蓋10分鐘，混勻，磁吸1分鐘，吸取DNA溶液保存至另一個離心管中，

所述氨基磷酸酯衍生物為α-氨基磷酸酯、β-氨基磷酸酯和γ-氨基磷酸酯的一種或多種，其中，所述氨基為無取代氨基、一取代氨基或二取代氨基，所述氨基的取代基為脂肪族基團，所述氨基磷酸酯為長度小于5個碳的脂肪醇磷酸酯。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的鐵氧體-二氧化硅核殼納米粒子，其內核是具有超順磁性的鐵氧體納米粒子，其外殼是二氧化硅。