[發(fā)明專利]一種單唾液酸四己糖神經節(jié)苷脂的合成方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010324378.2
• 申請日: 2020-04-23
• 公開（公告）號: CN111500660A
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發(fā)明（設計）人: 王鵬;曹學峰
• 申請（專利權）人: 武漢糖智藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12P19/44
• 分類號: C12P19/44
• 代理公司: 湖北天領艾匹律師事務所 42252
• 代理人: 程明

本發(fā)明涉及一種工業(yè)合成單唾液酸四己糖神經節(jié)苷脂的方法，以氟代乳糖(Lac?F)為原料，經過10種酶催化的五步連續(xù)反應制備單唾液酸四己糖神經節(jié)苷脂，并達到由克級至公斤級的制備規(guī)模，從而滿足了工業(yè)生產GM1的需求，取代了傳統(tǒng)從豬腦提取的工藝路線。另外，本專利將制備單唾液酸四己糖神經節(jié)苷脂的工藝縮短為五步，并且在前三個步驟中未純化中間產物，減少了因中間步驟純化引起的產品損耗，節(jié)約了時間成本。

【技術領域】

本發(fā)明涉及一種工業(yè)合成單唾液酸四己糖神經節(jié)苷脂的方法，屬于生物化學催化合成技術領域。

【背景技術】

單唾液酸四己糖神經節(jié)苷脂(GM1)，系自豬腦中提取制得的對神經細胞功能損傷具有作用的物質。其結構包括疏水的神經酰胺和親水的帶有唾液酸的寡糖鏈，兩端通過糖苷鍵連接在一起。疏水的神經酰胺主要包含鞘氨醇和脂肪酸，二者通過亞氨基連接。鞘氨醇由多羥基脂肪胺構成，鏈長為18或20個碳原子，其結構式為：

現(xiàn)有技術對于GM1的提取都立足于提高產品純度、收率，降低產品成本，減少毒害有機溶劑的使用量等方面進行了大量的研究并且市場已有單唾液酸四己糖神經節(jié)苷脂注射液、注射用單唾液酸四己糖神經節(jié)苷脂等多種產品在銷售使用。由于來源于生物原料豬腦，目前的提取技術不夠精細，采用生物化學合成的方式獲得的GM1是比較理想的方式。目前，合成GM1的技術存在一定的缺陷，合成周期長，步驟繁多，轉化率低。截止目前，有研究利用氟代乳糖為原料制備腫瘤疫苗GM3，而尚未有以氟代乳糖(Lac-F)為原料制備GM1的專利技術；另外，有文獻(“Strategies for chemoenzymatic synthesis of carbohydrates”Wanqing Li,John B.McArthur,Xi Che等，Carbohydrate research,2019年第472期，第86-97頁)利用鞘氨醇(Sphingosine)取代Lac-F中的氟而制備Lac-Sph，進而制備GM1的方案，但該方案存在轉化率低、每步反應均要純化的缺點，該過程增加了產品制備中的時間成本和勞動成本。另外有文獻(“One-pot multi-enzyme(OPME)systems for chemoenzymaticsynthesis of carbohydrates.”Hai Yu and Xi Chen等，Org.Biomol.Chem.,2016年第14期第2809-2818頁)介紹了以GalA作為底物利用多種酶合成UDP-GalNAc，但目前尚未有研究利用此方法高效合成GM1或其中間產物。

因此需要一種周期短、步驟簡便、成本低的GM1合成方法。

【發(fā)明內容】

本發(fā)明的目的是提供一種單唾液酸四己糖神經節(jié)苷脂GM1的合成方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的單唾液酸四己糖神經節(jié)苷脂GM1的合成，所述方法包括如下步驟：

1.采用NmCSS、PmST₁和PmPpA三種酶將氟代乳糖(Lac-F)、唾液酸(Neu5Ac)和三磷酸胞苷(CTP)催化生成GM3-F；

其中，所述底物氟代乳糖的摩爾濃度優(yōu)選為10-40mM，更優(yōu)選30mM；

所述底物氟代乳糖、唾液酸與三磷酸胞苷的摩爾濃度比優(yōu)選為1：(1.2-2)：(1.3-2)；更優(yōu)選1:1.7:1.6；

所述NmCSS的用量優(yōu)選為80-140U，更優(yōu)選100U；

所述PmST1的用量優(yōu)選為80-220U，更優(yōu)選180U；

所述反應溫度優(yōu)選為10-40℃，更優(yōu)選30℃；

所述反應的pH值優(yōu)選為7-9，更優(yōu)選為9。