[發明專利]一種單唾液酸四己糖神經節苷脂的合成方法

在審

• 申請號: 202010324378.2
• 申請日: 2020-04-23
• 公開（公告）號: CN111500660A
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發明（設計）人: 王鵬;曹學峰
• 申請（專利權）人: 武漢糖智藥業有限公司
• 主分類號: C12P19/44
• 分類號: C12P19/44
• 代理公司: 湖北天領艾匹律師事務所 42252
• 代理人: 程明

1.一種單唾液酸四己糖神經節苷脂的合成方法，其特征在于，包括以下步驟：

A.采用第一組合酶將氟代乳糖、唾液酸與三磷酸胞苷催化生成GM3-F；

B.采用N-乙酰半乳糖胺、三磷酸腺苷、三磷酸尿苷與GM3-F在第二組合酶的作用下催化生成GM2-F；

C.采用半乳糖、三磷酸腺苷、三磷酸尿苷與GM2-F在第三組合酶的作用下生產GM1-F；

D.采用第四酶將GM1-F在醇的作用下催化生成GM1-Sph；

E.用烷基酰氯與GM1-Sph合成得到單唾液酸四己糖神經節苷脂。

2.根據權利要求1所述的一種單唾液酸四己糖神經節苷脂的合成方法，其特征在于：

步驟A中所述第一組合酶為NmCSS、PmST1和PmPpA；

步驟B中所述第二組合酶為NahK、AGX1、PmPpA和CgtA，所述步驟B采用N-乙酰半乳糖胺與三磷酸尿苷、三磷酸腺苷在NahK、AGX1、PmPpA三種酶的作用下生成第一中間產物UDP-GalNac，然后UDP-GalNac與GM3-F在酶CgtA的作用下催化生成GM2-F；

步驟C中所述第三組合酶為GalK、AtUSP、PmPpA和CgtB，步驟C采用半乳糖、三磷酸腺苷和三磷酸尿苷在GalK、AtUSP、PmPpA三種酶的作用下生成第二中間產物UDP-Gal；然后UDP-Gal與GM2-F在酶CgtB的作用下生產GM1-F；

步驟D中所述第四酶為EGC II，步驟D采用酶EGC II將GM1-F、鞘氨醇在含乙醇體系下催化生成GM1-Sph；

步驟E采用十八碳酰氯與GM1-Sph合成GM1-C18，或采用二十碳酰氯和GM1-Sph合成GM1-C20。

3.根據權利要求2所述的單唾液酸四己糖神經節苷脂的合成方法，其特征在于步驟A中：

所述氟代乳糖的摩爾濃度為10-40mM；

所述氟代乳糖、唾液酸和三磷酸胞苷的摩爾濃度比為1：(1.2-2)：(1.3-2)；

所述NmCSS的用量為80-140U；

所述PmST1的用量為80-220U；

反應溫度為10-40℃，pH值為7-9。

4.根據權利要求2所述的單唾液酸四己糖神經節苷脂的合成方法，其特征在于步驟A中：

所述氟代乳糖的摩爾濃度為30mM；

所述氟代乳糖、唾液酸和三磷酸胞苷的摩爾濃度比為1：1.7：1.6；

所述NmCSS的用量為100U；

所述PmST1的用量為180U；

反應溫度為30℃，pH值為9。

5.根據權利要求2所述的單唾液酸四己糖神經節苷脂的合成方法，其特征在于步驟B中：

所述N-乙酰半乳糖胺的濃度為20-50mM；

所述N-乙酰半乳糖胺、三磷酸腺苷與三磷酸尿苷的摩爾濃度比為1：(1.2-1.3)：(1.2-1.3)；

所述NahK的用量為200-260U；

所述AGX1的用量為120-270U；

所述生成第一中間產物反應溫度為30-42℃，pH值為7-9；

所述GM3-F的濃度10-30mM；

所述GM3-F與第一中間產物的摩爾濃度比為1：1；

所述CgtA添加量為100-300U；

所述GM3-F與第一中間產物的反應溫度為25-40℃，pH值為7-9。

6.根據權利要求2所述的單唾液酸四己糖神經節苷脂的合成方法，其特征在于步驟B中：

所述N-乙酰半乳糖胺的濃度為30mM；

所述N-乙酰半乳糖胺、三磷酸腺苷與三磷酸尿苷的摩爾濃度比為1：1.3：1.2；

所述NahK的用量為240U；

所述AGX1的用量為170U；

所述生成第一中間產物反應溫度為37℃，pH值為9；

所述GM3-F的濃度15mM；

所述CgtA添加量為100-300U；

所述GM3-F與第一中間產物的反應溫度為37℃，pH值為9。