[發明專利]一種可條件性過表達HPV E7的小鼠成纖維細胞株及其應用在審

申請號：	202010324034.1	申請日：	2020-04-22
公開（公告）號：	CN111500544A	公開（公告）日：	2020-08-07
發明（設計）人：	袁奕;唐林香;張夢嬌;李昂;何勝祥	申請（專利權）人：	江蘇同科醫藥科技有限公司
主分類號：	C12N5/10	分類號：	C12N5/10;C12N15/85
代理公司：	上海精晟知識產權代理有限公司 31253	代理人：	輦甲武
地址：	215000 江蘇省蘇州市蘇州工***	國省代碼：	江蘇;32
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種條件表達 hpv e7 小鼠纖維細胞株及其應用
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【權利要求書】：

1.一種可條件性過表達HPV E7的小鼠成纖維細胞株，其特征在于，所述小鼠成纖維細胞株的構建包括以下步驟：

步驟一，HPV E7-H11 conditional knock in小鼠原代成纖維細胞分離；

步驟二，HPV E7-H11 cKI小鼠原代成纖維細胞永生化誘導與篩選；

步驟三，永生化-HPV E7-H11 cKI小鼠原代成纖維細胞Cre酶誘導與鑒定。

2.根據權利要求1所述的可條件性過表達HPV E7的小鼠成纖維細胞株，其特征在于，

步驟一，HPV16 E7-H11 conditional knock in小鼠原代成纖維細胞分離

步驟1-1、取經基因型鑒定的同窩6-8周雌性小鼠各一只，安樂死后剪取小鼠尾巴，75％酒精浸泡消毒后轉移至超凈工作臺內，置于裝有含1％青霉素/鏈霉素雙抗的磷酸鹽緩沖液培養皿中；

步驟1-2、洗去小鼠尾巴表面毛發，手術刀移去表面皮膚，再放入Ca²⁺,Mg²⁺磷酸鹽緩沖液中洗3遍，以去除殘留血液與脂肪組織，用眼科剪將鼠尾剪成2mm左右的組織小塊；

步驟1-3、小心放入六孔板中，六孔板含600μL完全培養液，高糖DMEM+1％雙抗+10％胎牛血清，確保組織塊均勻且充分貼住六孔板底，置于37℃，5％CO，90％濕度的細胞培養箱培養24h；

步驟1-4、次日補加3mL完全培養基，培養3-5天，每2天換一次液；約8-10天后，細胞可達80-100％接合度，采用差速貼壁法進行消化傳代以純化目的細胞，成纖維細胞完全貼壁時間＜2小時；

步驟二，HPV16 E7-H11 cKI小鼠原代成纖維細胞永生化誘導與篩選

基于步驟1分離所得HPV E7-H11 cKI小鼠原代成纖維細胞，對其進行永生化誘導與篩選：

步驟2-1、永生化病毒包裝

步驟2-(1)第一天，取對數生長期HEK-293T鋪板，調節細胞濃度至4*10⁶個細胞/dish；

步驟2-(2)第二天，待細胞生長至80％-90％接合度，換液9mL，并按如下比例配制轉染體系：1mL opti-MEM中，加入pLenti-SV40 LT-puro質粒10μg，psPAX2 10μg，pMD2.G 5μg，及PEI轉染試劑60μL；充分混勻后室溫靜置20min，隨后逐滴加入培養體系中；

步驟2-(3)第三天，細胞換為6mL新鮮培養基；

步驟2-(4)第五天，收集細胞上清，300g離心后，采用0.45μm孔徑大小的微孔濾膜過濾病毒液，分裝后保存于-80度備用，避免反復凍融；

步驟2-2、細胞永生化誘導

步驟2-(1)待六孔板中原代成纖維細胞接合度至30-50％時，加入2mL病毒液，同時加入促感染劑聚凝胺；

步驟2-(2)次日更換新的病毒液，共復感三次；

步驟2-(3)換回常規培養基，監測細胞生長狀況，以含嘌呤霉素的培養基篩選，每三天換液一次；直到抗性群落能被識別出，即對照細胞全部死亡時，繼續傳代培養篩選得到的細胞；

步驟3，永生化-HPV16 E7-H11 cKI小鼠原代成纖維細胞Cre酶誘導與鑒定

基于步驟2分離所得永生化HPV16 E7-H11 cKI小鼠原代成纖維細胞，對其進行Cre誘導與篩選：

步驟3-1、Cre病毒包裝

步驟3-(1)第一天，取對數生長期HEK-293T鋪板，調節細胞濃度至4*10⁶個細胞/dish；

步驟3-(2)第二天，待細胞生長至80％-90％接合度，換液9mL，并按如下比例配制轉染體系：1mL opti-MEM中，加入CRE-IRES-mCherry質粒10μg，psPAX2 10μg，pMD2.G 5μg，及PEI轉染試劑60μL；充分混勻后室溫靜置20min，隨后逐滴加入培養體系中；

步驟3-(3)第三天，細胞換為6mL新鮮培養基；