[發(fā)明專利]一種可條件性過表達HPV E7的小鼠成纖維細胞株及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010324034.1
• 申請日: 2020-04-22
• 公開（公告）號: CN111500544A
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 袁奕;唐林香;張夢嬌;李昂;何勝祥
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇同科醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85
• 代理公司: 上海精晟知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31253
• 代理人: 輦甲武

一種可條件性過表達HPV E7的小鼠成纖維細胞株及其應(yīng)用，鼠成纖維細胞株的構(gòu)建包括以下步驟：步驟一，cKI小鼠原代成纖維細胞分離；步驟二，cKI小鼠原代成纖維細胞永生化誘導(dǎo)與篩選；步驟三，永生化?cKI小鼠原代成纖維細胞Cre酶誘導(dǎo)與鑒定。本發(fā)明將啟動子序列定點嵌入到小鼠基因組H11位點，只有在特定Cre酶存在情況下，才會在特異細胞或組織中表達目的基因，本發(fā)明通過系列原代細胞分離、永生化及體外Cre誘導(dǎo)的步驟，提供了種可條件性過表達HPV E7的小鼠成纖維細胞株及其應(yīng)用，有效解決當(dāng)前技術(shù)存在問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種可條件性過表達HPV E7的小鼠成纖維細胞株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在婦科惡性腫瘤中僅次于乳腺癌。近年來我國宮頸癌發(fā)病率呈上升態(tài)勢，且趨于年輕化。人乳頭瘤病毒(HPV)屬乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬，是一種球形DNA病毒。目前已有200多種HPV亞型被鑒定，根據(jù)其致癌性可分為高危型HPV(hrHPV)與低危型HPV(1rHPV)。持續(xù)性hrHPV感染是宮頸高度病變及宮頸癌發(fā)生的主要誘因，90％以上的宮頸癌組織攜帶hrHPV(16，18，31型)DNA，但HPV感染導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的分子機制仍不太明了。HPV基因組分為3個部分：早期基因區(qū)(E)、晚期基因區(qū)(L)及長調(diào)控區(qū)(LCR)。其中，早期基因區(qū)(E)的E7是明確的致癌基因。hrHPV(如HPV16)E7可編碼具有轉(zhuǎn)化及反式激活功能的蛋白，其陽性表達與宮頸病變程度之間呈正相關(guān)，被證實是導(dǎo)致宮頸上皮癌變的重要因子。且不同型的HPV致癌能力與其各自E7與Rb蛋白結(jié)合能力等有關(guān)，結(jié)合越緊密，其致癌能力越強。對E7基因及其蛋白產(chǎn)物在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的機制、宮頸癌診療與疫苗研發(fā)等方面開展深入研究具有重要的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。

研究認為，HPV可通過微小的創(chuàng)口感染鱗狀上皮基底層細胞，與基底層細胞表面受體結(jié)合并黏附于細胞表面。其病毒體(virion)進入細胞所需的條件還不清楚。病毒一旦進入細胞，HPV DNA可在基底層細胞向表層上皮分化的過程中復(fù)制。目前針對HPV及E7等癌基因的研究主要集中于角質(zhì)細胞、上皮來源腫瘤細胞。

然而，不可忽視的是，腫瘤是由腫瘤細胞及其周圍基質(zhì)細胞和非細胞組分構(gòu)成的復(fù)合體，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是腫瘤細胞與其微環(huán)境相互促進、共同演化的動態(tài)過程。例如，腫瘤相關(guān)成纖維細胞，作為腫瘤微環(huán)境中最主要的組成成分之一，被報道與腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成與耐藥性獲得等過程密切相關(guān)，可通過打破組織細胞間的穩(wěn)態(tài)，繼而使微環(huán)境更有利于腫瘤生長。大量研究提示，腫瘤組織中的成纖維細胞可在腫瘤細胞的某種調(diào)控下轉(zhuǎn)化成為腫瘤相關(guān)成纖維細胞，繼而與腫瘤細胞相互調(diào)節(jié)，共同促進疾病惡性進展。新近研究發(fā)現(xiàn)，在HPV⁺腫瘤細胞/角質(zhì)細胞外泌體中可檢測到E7等癌基因的表達，且部分臨床樣本免疫組化結(jié)果提示，該類分子可在成纖維細胞中檢測到，那么以E7為代表的HPV癌基因是否可借助外泌體等傳遞介質(zhì)，進入成纖維細胞，進而產(chǎn)生系列潛在的、未知的病理效應(yīng)。是否可促進成纖維細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤相關(guān)成纖維細胞，參與宮頸癌惡性進展。上述科學(xué)問題的探討，對于全面評價hrHPV E7的促癌機制，尤其是在誘導(dǎo)正常細胞惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤微環(huán)境調(diào)控等過程具有重要意義。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，目前技術(shù)存在以下不足之處：

1、目前針對HPV及E7等癌基因的研究主要集中于角質(zhì)細胞、上皮來源腫瘤細胞，而對于以E7為代表的HPV癌基因在成纖維細胞及腫瘤微環(huán)境中的研究尚且不足。