[發明專利]一種表達ASFV P30蛋白的PRV gE/gI雙基因缺失株的構建方法

在審

• 申請號: 202010322977.0
• 申請日: 2020-04-22
• 公開（公告）號: CN111471657A
• 公開（公告）日: 2020-07-31
• 發明（設計）人: 徐志文;朱玲;曾喻兵
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/34;C12N15/85;C12N15/66;A61P31/20;A61P31/22
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 劉妮

本發明公開了生物醫藥領域的一種表達ASFV P30蛋白的PRV gE/gI雙基因缺失株的構建方法，具體包括以下步驟，S1：試劑準備；S2：克隆質粒的制備；S3：構建PRV真核轉移質粒pEGFP?CP204L；S4：PRV和pEGFP?CP204L質粒DNA的共轉染；合成P30蛋白基因(CP204L)片段，構建轉移質粒pEGFP?CP204L，利用經典的同源重組方式將ASFV CP204L基因插入PRV基因組替換gI和gE毒力基因，構建共表達P30蛋白的重組偽狂犬病毒株rXJ gE/gI?CP204L可用于預防ASFV和PRV感染；克隆質粒制備簡單，成本較低，適用于產業化生產。

技術領域

本發明涉及生物醫藥技術領域，具體為一種表達ASFV P30蛋白的PRV gE/gI雙基因缺失株的構建方法。

背景技術

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性、致死性動物傳染病。非洲豬瘟除了能夠感染所有品種和各年齡段的豬，其中表現為高熱、全身出血、呼吸障礙和神經癥狀等癥狀。由于非洲豬瘟病毒毒力差異，非洲豬瘟的感染過程和臨床癥狀有明顯的差異，最急性和急性型感染致死率高達100％。至今世界范圍內無有效疫苗，ASFV的擴散額蔓延將給養豬業帶來毀滅性的打擊。2018年8月3日，我國首次爆發非洲豬瘟疫情，截止2019年9月17日，全國已有31個省份發生非洲豬瘟疫情共154起，給中國養豬業帶來巨大經濟損失。p30蛋白在病毒感染的早期進行表達，具有比較好的抗原性，因此可以用該基因開發非洲豬瘟疫苗。

偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus)是豬奧耶斯基氏病(Aujeszky’s disease)的病原，該病毒屬于皰疹病毒科(Herpesviridae)甲型皰疹病毒亞科(Alphaherpesvirinae)水痘病毒屬(Varicellovirus)。PRV感染不同年齡段的豬只表現為不同的臨床癥狀，新生仔豬主要表現為神經癥狀和腦膜腦炎，育肥豬表現為呼吸系統障礙，懷孕母豬表現為流產、產死胎、木乃伊胎和弱仔。

偽狂犬病毒基因組龐大，是很好的疫苗載體，通過對病毒復制中非必須基因的缺失，插入外源基因可以構建含有外源基因的重組疫苗。因此可利用本實驗室保存PRV XJ株和pEGFP-gI28k真核表達質粒，構建表達ASFV P30蛋白的PRV gE/gI雙基因缺失株，為研發非洲豬瘟病毒重組疫苗做鋪墊。

基于此，本發明設計了一種表達ASFV P30蛋白的PRV gE/gI雙基因缺失株的構建方法，以解決上述提到的問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種表達ASFV P30蛋白的PRV gE/gI雙基因缺失株的構建方法，構建表達ASFV P30蛋白的PRV gE/gI雙基因缺失株，填補現有的空白區域，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種表達ASFV P30蛋白的PRV gE/gI雙基因缺失株的構建方法，具體包括以下步驟，

S1：試劑準備：

LB液體培養基；限制性快切酶(Xho I、Sal I)；Lipefectamine TM 3000轉染試劑；去內毒素質粒小量抽提試劑盒；DH5α大腸桿菌感受態細胞；

S2：克隆質粒的制備：

S2.1：在P30蛋白基因(CP204L)5’端引入Xho I酶切位點，3’端引入Sal I酶切位點，酶切位點后加AA堿基，合成CP204L基因片段，將CP204L基因片段克隆至載體pMD19-T的多克隆位點上，得重組質粒，即為親本pMD19-CP204L；

S2.2：將上述親本質粒轉化DH5α大腸桿菌感受態細胞，過夜培養，挑取白色轉化菌落，提取質粒后質粒酶切電泳及質粒測序驗證插入正確的片段。