[發明專利]一種表達ASFV P30蛋白的PRV gE/gI雙基因缺失株的構建方法

在審

• 申請號: 202010322977.0
• 申請日: 2020-04-22
• 公開（公告）號: CN111471657A
• 公開（公告）日: 2020-07-31
• 發明（設計）人: 徐志文;朱玲;曾喻兵
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/34;C12N15/85;C12N15/66;A61P31/20;A61P31/22
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 劉妮

1.一種表達ASFV P30蛋白的PRV gE/gI雙基因缺失株的構建方法，其特征在于：具體包括以下步驟，

S1：試劑準備：

LB液體培養基；限制性快切酶(Xho I、Sal I)；Lipefectamine TM 3000轉染試劑；去內毒素質粒小量抽提試劑盒；DH5α大腸桿菌感受態細胞；

S2：克隆質粒的制備：

S2.1：在P30蛋白基因(CP204L)5’端引入Xho I酶切位點，3’端引入Sal I酶切位點，酶切位點后加AA堿基，合成CP204L基因片段，將CP204L基因片段克隆至載體pMD19-T的多克隆位點上，得重組質粒，即為親本pMD19-CP204L；

S2.2：將上述親本質粒轉化DH5α大腸桿菌感受態細胞，過夜培養，挑取白色轉化菌落，提取質粒后質粒酶切電泳及質粒測序驗證插入正確的片段。

S3：構建PRV真核轉移質粒pEGFP-CP204L：

S3.1：pEGFP-gI28k質粒DNA抽提；

S3.2：pMD19-CP204L和pEGFP-gI28k質粒的酶切回收；

S3.3：基因和質粒pEGFP-gI28K的連接；

S3.4：感受態細胞的轉化；

S3.5：PRV真核轉移質粒pEGFP-CP204L去內毒素質粒提取。

S4：PRV和pEGFP-CP204L質粒DNA的共轉染：

先將pEGFP-CP204L質粒DNA根據Lipefectamine TM 3000轉染試劑盒說明書轉染入293T細胞，在轉染10h后加入PRV XJ株病毒液，同源重組構建gE基因和gI基因缺失，共表達CP204L基因的重組偽狂犬病毒株rXJ gE/gI-CP204L。

2.根據權利要求1所述的一種表達ASFV P30蛋白的PRV gE/gI雙基因缺失株的構建方法，其特征在于：所述步驟S1中，LB液體培養基是將酵母粉5g，胰蛋白胨10g和NaCl 10g溶解在1L蒸餾水中，調至pH＝7.2～7.6，待各組分溶解后高壓滅菌得到。

3.根據權利要求1所述的一種表達ASFV P30蛋白的PRV gE/gI雙基因缺失株的構建方法，其特征在于：所述步驟S3.1實現的具體步驟為：將pEGFP-gI28k菌種接入含50μg/mlkana的LB液體培養基中，37℃，300rpm過夜培養，用試劑盒抽提質粒DNA。

4.根據權利要求1所述的一種表達ASFV P30蛋白的PRV gE/gI雙基因缺失株的構建方法，其特征在于：所述步驟S3.2實現的具體步驟為：將pEGFP-gI28k質粒DNA與S2.2操作步驟中已抽提的克隆pMD19-CP204L質粒進行雙酶切，回收CP204L目的基因序列和pEGFP-gI28k線性質粒。

5.根據權利要求1所述的一種表達ASFV P30蛋白的PRV gE/gI雙基因缺失株的構建方法，其特征在于：所述步驟S3.3實現的具體步驟為：根據回收片段和質粒濃度制定連接體系，恒溫金屬浴上16℃連接過夜10h。

6.根據權利要求1所述的一種表達ASFV P30蛋白的PRV gE/gI雙基因缺失株的構建方法，其特征在于：所述步驟S3.4實現的具體步驟為：連接產物轉化DH5α大腸桿菌感受態細胞，過夜培養，挑取白色轉化菌落，利用CP204L基因引物(5’-ATGAAAATGGAGGTCATC，3’-TTATTTTTTTTTAAAAGTTTAATGACC)PCR擴增篩選陽性克隆，提取質粒后質粒酶切電泳及質粒測序驗證插入正確的片段。

7.根據權利要求1-6任一所述的一種表達ASFV P30蛋白的PRV gE/gI雙基因缺失株的構建方法，其特征在于：所述的構建方法用于預防ASFV和PRV感染。