[發明專利]一種生產角蛋白酶的方法

有效

• 申請號: 202010322352.4
• 申請日: 2020-04-22
• 公開（公告）號: CN111424026B
• 公開（公告）日: 2022-05-24
• 發明（設計）人: 張娟;冒鑫哲;萬云蕾;陳堅;郭榮;鄧小華;李江華;周冠宇
• 申請（專利權）人: 江南大學;武漢工控工業技術研究院有限公司
• 主分類號: C12N9/54
• 分類號: C12N9/54;C12N1/20;C12P21/06;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種生產角蛋白酶的方法，屬于微生物和發酵技術領域。本發明通過從發酵培養基成分(碳源、氮源、金屬離子、磷酸鹽)和發酵條件(溫度、pH、接種量)兩個方面入手，對利用枯草芽孢桿菌發酵生產角蛋白酶的工藝進行了優化。利用本發明的方法發酵生產角蛋白酶，可使得角蛋白酶的產量較對照提高3.3倍，在3L發酵罐產酶，酶活達到704400U/mL。因而本發明的方法在飼料、制革等方面角蛋白酶的制備中有著廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種生產角蛋白酶的方法，屬于微生物和發酵技術領域。

背景技術

角蛋白酶是一種可以特異性降解角蛋白類底物的蛋白酶。產角蛋白酶的微生物主要為細菌、真菌、放線菌。目前，針對角蛋白酶發酵優化的研究，主要集中在野生菌的篩選、發酵培養基成分優化和發酵條件優化，在產角蛋白酶菌株資源的挖掘中，最常見的是細菌，具有發酵周期短、酶活高、生產安全性好等特點，角蛋白酶在飼料、肥料、洗滌劑、皮革、紡織、化妝品行業和醫療等領域具有很好的應用前景。隨著人們對角蛋白酶的催化性質在工業應用潛力認識的不斷加深，野生菌所產角蛋白酶的性能和產量遠遠不能滿足市場需求。目前篩選得到的產角蛋白酶野生菌大多集中在枯草桿菌屬，其胞外分泌的酶種類多，底物作用專一性差，而且產酶不穩定，不利于工業化生產。近年來越來越多的角蛋白酶基因得到克隆和異源表達，采用基因工程菌，強化基因轉錄和翻譯，達到高效表達和活性分泌，可以有效提高角蛋白酶的生產強度。基因工程菌和重組角蛋白酶經過性能改造，胞外分泌酶單一，簡化了發酵下游的純化工作。然而，高生產成本和低產量限制了角蛋白酶的工業化生產，因此通過發酵優化技術手段來提高產量降低成本。

發明內容

為了解決角蛋白酶生產菌株發酵酶活低，發酵成本過高的問題。本發明的方法從發酵培養基成分(碳源、氮源、金屬離子、磷酸鹽)和發酵條件(溫度、pH、接種量)兩個方面入手，對利用枯草芽孢桿菌發酵生產角蛋白酶的工藝進行了進一步優化；利用本發明的方法發酵生產角蛋白酶，可使得角蛋白酶的產量得到提升，在飼料、制革等方面有著廣闊的應用前景。

本發明對發酵培養基進行優化。首先利用單因素試驗對培養基成分和培養條件進行了優化；然后設計Plackett-Burman試驗篩選得到三個顯著因素：酵母浸膏、pH、溫度；最后設計Box-Behnken中心組合試驗并進行響應面分析。獲得最佳工藝進行驗證以及高密度發酵。

本發明提供了一種培養基，所述培養基的組分為蔗糖、豆粕、酵母浸膏、Na₂HPO₄·12H₂O、KH₂PO₄和MgSO₄·7H₂O。

在本發明的一種實施方式中，所述蔗糖的含量為20～40g/L。

在本發明的一種實施方式中，所述豆粕的含量為35～45g/L。

在本發明的一種實施方式中，所述酵母浸膏的含量為5～10g/L或25～30g/L。

在本發明的一種實施方式中，所述Na₂HPO₄·12H₂O的含量為2～20g/L。

在本發明的一種實施方式中，所述KH₂PO₄的含量為1～10g/L。

在本發明的一種實施方式中，所述MgSO₄·7H₂O的含量為0.1～1.0g/L。

本發明提供了一種提高角蛋白酶產量的方法，所述方法是將角蛋白酶發酵菌株接種至所述培養基中產酶。

在本發明的一種實施方式中，所述角蛋白酶發酵菌株的接種量為發酵培養基的4～7％(v/v)，接種時菌液的OD₆₀₀為0.6～1.0。