[發(fā)明專利]CHOK1懸浮馴化無血清培養(yǎng)基及懸浮馴化方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010320852.4
• 申請(qǐng)日: 2020-04-22
• 公開（公告）號(hào): CN111471644A
• 公開（公告）日: 2020-07-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許園元;高云霞;董庸行;宋彥凌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 常州艾米能斯生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 常州市英諾創(chuàng)信專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32258
• 代理人: 王美華

本發(fā)明公開一種CHOK1懸浮馴化無血清培養(yǎng)基及懸浮馴化方法，無血清培養(yǎng)基中包含EmCD CHO Medium、Glutamine、HT及抗結(jié)團(tuán)劑，基于該培養(yǎng)基可實(shí)現(xiàn)15天完成基本馴化，細(xì)胞活率大于95％。自接種至含EmCD CHO Medium的馴化培養(yǎng)基進(jìn)行搖床懸浮培養(yǎng)至完成基本馴化，再至穩(wěn)定傳代，整個(gè)過程僅需24天。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種CHOK1懸浮馴化無血清培養(yǎng)基及懸浮馴化方法。

背景技術(shù)

CHOK1(也稱CHO-K1)為轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，細(xì)胞染色體分布頻率是2n＝22，系亞二倍體細(xì)胞。ATCC保存CHOK1細(xì)胞株，編號(hào)為CCL-61，被廣泛地用于重組DNA蛋白的表達(dá)。該細(xì)胞可從各大保藏中心采購或者個(gè)人實(shí)驗(yàn)室保存的細(xì)胞獲得。CHOK1細(xì)胞系通常是在含10％的優(yōu)質(zhì)胎牛血清(fetal bovine serum，簡(jiǎn)稱FBS)的培養(yǎng)基中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)成本較高，且由于血清中很容易攜帶外源病毒、補(bǔ)體等物質(zhì)而導(dǎo)致細(xì)胞的培養(yǎng)效果不穩(wěn)定或者引入安全風(fēng)險(xiǎn)。所以，在現(xiàn)在生物醫(yī)藥開發(fā)中，通常將貼壁血清培養(yǎng)的CHOK1細(xì)胞懸浮馴化至無血清懸浮高密度生長(zhǎng)。但由于目前沒有效果突出的馴化培養(yǎng)基及馴化方法，導(dǎo)致貼壁懸浮馴化過程漫長(zhǎng)(5-10個(gè)月)且存在較大的失敗概率，即使馴化成功，也容易出現(xiàn)細(xì)胞易結(jié)團(tuán)、活率低、倍增時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，中國(guó)專利文獻(xiàn)(申請(qǐng)?zhí)枮?01811054625.0)中公開的CHO-K1懸浮馴化培養(yǎng)基及馴化方法，雖然懸浮培養(yǎng)時(shí)間縮短，但過程較復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明提供一種馴化時(shí)間短，細(xì)胞活率高的CHOK1細(xì)胞懸浮馴化方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種CHOK1懸浮馴化無血清培養(yǎng)基，包括如下重量組分：

一種CHOK1細(xì)胞懸浮馴化方法，包括如下步驟：

步驟1，貼壁轉(zhuǎn)懸浮：使用F-12K+10％FBS培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞匯合度達(dá)到70-80％，加胰酶消化，緩慢吹打混勻，按0.5×10⁶cells/ml接種至含10％FBS的F-12K培養(yǎng)基中搖瓶傳代，2天后細(xì)胞密度達(dá)到1×10⁶cells/ml，水平離心5±1min收集細(xì)胞；

步驟2，懸浮馴化恢復(fù)：將步驟1中搖床搖床傳代后收集的細(xì)胞以0.5×10⁶cells/ml密度接種到如上所述的CHOK1懸浮馴化無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)搖床懸浮培養(yǎng)，5天后細(xì)胞增殖為1.6×10⁶cells/ml，細(xì)胞活率達(dá)到88.88％，直接取懸液以0.5×10⁶cells/ml傳代，4天后細(xì)胞活率為92.6％，接下來取懸液以0.8×10⁶cells/ml密度傳代，連續(xù)傳3代后，完成CHOK1細(xì)胞基本馴化；接下來以0.3×10⁶cells/ml傳代，每3天傳代一次，連續(xù)傳3代，細(xì)胞倍增時(shí)間穩(wěn)定在23～24h，細(xì)胞懸浮馴化完成。

進(jìn)一步的，步驟1中搖瓶傳代培養(yǎng)條件為于37±0.5℃，5±0.5％CO₂，125±5rpm搖床中懸浮培養(yǎng)。

進(jìn)一步的，步驟1中細(xì)胞收集方法為取細(xì)胞密度達(dá)到1×10⁶cells/ml的細(xì)胞懸液，水平離心5±1min后，收集細(xì)胞沉淀。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明取得的技術(shù)效果為：15天完成基本馴化，細(xì)胞活率大于95％。自接種至含EmCD CHO Medium的馴化培養(yǎng)基進(jìn)行搖床懸浮培養(yǎng)至完成基本馴化，再至穩(wěn)定傳代(即CHOK1細(xì)胞懸浮馴化完成)，整個(gè)過程僅需24天。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中CHOK1細(xì)胞在含EmCD CHO Medium的CHOK1懸浮馴化無血清培養(yǎng)基中的馴化數(shù)據(jù)。