[發明專利]一種基于CRISPR-Cas9系統進行芽孢桿菌基因組編輯的方法及其應用

在審

• 申請號: 202010319490.7
• 申請日: 2020-04-22
• 公開（公告）號: CN111893139A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 張霞
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物股份有限公司;青島蔚藍生物集團有限公司
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/75;C12N15/113;C12N9/22
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及基因工程技術領域，提供了一種基于CRISPR?Cas9系統進行芽孢桿菌基因組編輯的方法。所述方法利用待編輯基因敲除盒或表達盒的PCR片段直接與Cas9表達質粒或Cas9?sgRNA復合物共轉化芽孢桿菌宿主細胞，實現芽孢桿菌基因組的高效、無抗生素標記基因編輯。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種利用CRISPR-Cas9進行芽孢桿菌基因組編輯的方法及其應用。

背景技術

CRISPR-Cas，為規律成簇間隔短回文重復(clustered regularly interspacedshort palindromic repeats，CRISPR)及其介導的基因剪切系統(CRISPR-associated，Cas)，是一類在細菌和古細菌中普遍存在的免疫系統，它可以高效識別并切割進入細胞的外源DNA。目前，來自于化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的天然CRISPR/Cas9系統應用最廣泛。該系統包含由crRNA和tracrRNA構成的復合體，在特異性PAM序列輔助下完成對目標序列的切割，已成功應用于多種微生物的基因編輯，可實現快速、高效地定向修飾。

枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，具有非致病性、高效的分泌信號肽及分子伴侶系統及良好的發酵基礎及生產技術，是目前原核表達系統中表達和分泌外源蛋白的最理想宿主，為工業應用中重要的模式菌株?？莶菅挎邨U菌分泌的重組蛋白大多具有天然構象和生物活性，避免形成包涵體；目標蛋白表達周期短，產率高。在基因工程操作過程中，篩選標記是重組DNA載體的重要組成部分，通常用來驗證轉化子是否成功。目前，枯草芽孢桿菌表達系統中，常用的篩選標記是抗生素抗性基因。但抗生素抗性基因這一新型污染物不僅能在宿主細菌中伴隨細菌增殖而增加豐度，還會通過基因突變和基因水平轉移增加多樣性、宿主范圍及豐度。2016年11月，來自英國牛津大學等機構的研究人員，用新的實驗模型證實質粒DNA是擴散抗生素耐藥性的全球健康重大威脅的元兇之一。他們發現質粒DNA能夠作為一種進化促進劑，加快新的耐藥性類型進化。此外，質粒自動地擴增這些新的功能獲得改善的耐藥性基因的拷貝數。這些發現表明抗生素質粒對公共環境和衛生帶來巨大的的威脅。

近年來，隨著分子生物學和基因工程的發展，如何利用CRISPR-Cas系統開發無抗生素標記遺傳操作技術，快速和高效地對芽孢桿菌基因組進行編輯，成為本領域的研究熱點。

發明內容

本發明為解決現有技術問題，提供了一種基于CRISPR-Cas9系統進行芽孢桿菌基因組編輯的方法。所述方法利用待編輯基因敲除盒或表達盒的PCR片段直接與Cas9表達質?；駽as9-sgRNA復合物共轉化芽孢桿菌宿主細胞，實現芽孢桿菌基因組的高效、無抗生素標記基因編輯。

本發明涉及一種基于CRISPR-Cas9系統進行芽孢桿菌基因組編輯的方法，包括：

(1)構建Cas9表達質?；蝮w外組裝Cas9蛋白和sgRNA mRNA的復合物Cas9-sgRNA；

(2)PCR擴增無篩選標記、包含上下游同源臂的待編輯基因敲除盒或表達盒；

(3)將步驟(2)獲得的PCR擴增片段與Cas9表達質粒或與Cas9-sgRNA復合物和溫敏質粒共轉化(轉染)芽孢桿菌宿主細胞；

(4)去除芽孢桿菌中的Cas9表達質粒或溫敏質粒，篩選得到芽孢桿菌工程菌，實現待編輯基因敲除或外源基因整合。

步驟(1)中所述Cas9表達質粒由f1、f2和f3這三個片段融合而成，其中f1包含Cas9基因的啟動子、溫敏復制子、卡那霉素抗性基因、大腸桿菌復制子；f2包含Cas9基因；f3包含待編輯基因的特異性sgRNA轉錄盒。

所述f1片段中啟動子的核苷酸序列為SEQ ID NO:1，溫敏復制子的核苷酸序列為SEQ ID NO:2，卡那霉素抗性基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:3，大腸桿菌復制子的核苷酸序列為SEQ ID NO:4。