[發明專利]一種基于CRISPR-Cas9系統進行芽孢桿菌基因組編輯的方法及其應用

在審

• 申請號: 202010319490.7
• 申請日: 2020-04-22
• 公開（公告）號: CN111893139A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 張霞
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物股份有限公司;青島蔚藍生物集團有限公司
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/75;C12N15/113;C12N9/22
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于CRISPR-Cas9系統進行芽孢桿菌基因組編輯的方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）構建Cas9表達質粒或體外組裝Cas9蛋白和sgRNA mRNA的復合物Cas9-sgRNA；

（2）PCR擴增無篩選標記、包含上下游同源臂的待編輯基因敲除盒或表達盒；

（3）將步驟（2）獲得的PCR擴增片段與Cas9表達質粒或與Cas9-sgRNA復合物和溫敏質粒共轉化（轉染）芽孢桿菌宿主細胞；

（4）去除芽孢桿菌中的Cas9表達質粒或溫敏質粒，篩選得到芽孢桿菌工程菌，實現待編輯基因敲除或外源基因整合。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1）中所述Cas9表達質粒由f1、f2和f3這三個片段融合而成，其中f1包含Cas9基因的啟動子、溫敏復制子、卡那霉素抗性基因、大腸桿菌復制子；f2包含Cas9基因；f3包含待編輯基因的特異性sgRNA轉錄盒。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述f1片段中啟動子的核苷酸序列為SEQ IDNO:1，溫敏復制子的核苷酸序列為SEQ ID NO:2，卡那霉素抗性基因的核苷酸序列為SEQ IDNO:3，大腸桿菌復制子的核苷酸序列為SEQ ID NO:4；所述f2片段中Cas9基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:5；所述f3片段中sgRNA轉錄盒的啟動子序列為SEQ ID NO:6；sgRNA的核苷酸序列為SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:15。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1）中所述復合物Cas9-sgRNA的體外組裝方法，包括：

（a）在大腸桿菌中表達Cas9蛋白，并進行純化；

（b）體外轉錄得到待編輯基因的特異性sgRNA mRNA，并進行純化；

（c）將純化的Cas9蛋白與sgRNA mRNA按分子摩爾比1:3進行體外組裝，獲得復合物Cas9-sgRNA。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟（a）中所述Cas9蛋白的核苷酸序列為SEQID NO:18；步驟（b）中所述體外轉錄得到的sgRNA mRNA的核苷酸序列為SEQ ID NO:19或SEQID NO:20。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2）中所述待編輯基因為aprE基因、nprE基因、spo0IIE基因或堿性蛋白酶基因。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述aprE基因敲除盒或堿性蛋白酶基因表達盒的上游同源臂的核苷酸序列為SEQ ID NO:8，下游同源臂的核苷酸序列為SEQ ID NO:9。

8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述nprE基因敲除盒的上游同源臂的核苷酸序列為SEQ ID NO:11，下游同源臂的核苷酸序列為SEQ ID NO:12。

9.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述spo0IIE基因的上游同源臂的核苷酸序列為SEQ ID NO:16，下游同源臂的核苷酸序列為SEQ ID NO:17。

10.如權利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，所述芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、克勞氏芽孢桿菌（Bacillus clausii）或解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）中的任意一種。