[發明專利]通過外周血循環腫瘤細胞檢測結直腸癌患者BRAF基因V600E突變的非診斷目的方法

在審

• 申請號: 202010317419.5
• 申請日: 2020-04-21
• 公開（公告）號: CN111521797A
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發明（設計）人: 李勝;黃寧;劉智鴻;李浩
• 申請（專利權）人: 山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;C12N5/09
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

本發明提供通過外周血循環腫瘤細胞檢測結直腸癌患者BRAF基因V600E突變的非診斷目的方法，屬于分子生物學領域，檢測方法主要包括采集外周血，處理外周血，過濾富集循環腫瘤細胞，免疫組化方法檢測循環腫瘤細胞BRAF基因V600E突變表達情況。本發明提供的檢測方法，不用穿刺活檢獲取組織標本即可檢測到結直腸癌患者BRAF基因V600E突變表達情況。該技術屬于微創，并能夠實時檢測。同時，能夠避免染色過程中可能產生的邊緣效應導致的假陽性結果，穩定性好，降低細胞的損失，提高檢測的準確性。

技術領域

本發明涉及一種檢測BRAF基因V600E突變的新方法，尤其是通過外周血檢測無法獲取組織標本的晚期或復發結直腸癌患者BRAF基因V600E突變的方法。

背景技術

結直腸癌（colorectal cancer,CRC）是我國常見的消化道惡性腫瘤之一。據統計，CRC的發病率及死亡率位居各惡性腫瘤的前列并呈上升的趨勢。但其致病因素和發病機制仍未完全清楚，目前認為是多基因共同參與調控的復雜過程，涉及癌基因（如RAF等）的異常激活和抑癌基因（如APC、P53等）失活。有研究表明，BRAF基因在結直腸癌的發病機制和治療方面都起著重要作用。但BRAF基因在結直腸癌中突變特征及二者之間的關系與臨床病理學的關系尚未見多項研究報道。

BRAF基因位于是人染色體7q34的原癌基因，編碼絲氨酸/蘇氨酸特異性激酶，是調節絲氨酸/蘇氨酸激酶的RAF基因和MAPK信號傳導級聯的活化劑，激活突變后可在癌癥發展中起致癌作用。研究發現BRAF突變可抑制結腸上皮細胞凋亡同時促進細胞增殖，促進癌細胞無限增殖、存活、遷移。即使在不存在細胞因子等刺激的情況下，BRAF中的V600E突變也可使該信號通路被激活，導致細胞無限增殖，最終發生癌癥。基于腫瘤BRAF基因的突變，目前臨床標本主要為腫瘤組織，來源于手術或穿刺活檢，很難做到多次或實時檢測。

目前，山東省第一醫科大學、山東省藥物研究院聯合山東祺欣生物科技有限公司、山東喻曉生物科技有限公司、濟南杏恩生物科技有限公司、山東發現生物技術有限公司等單位，對于循環腫瘤細胞檢測鑒定關鍵技術進行產業化推廣的研究，本項目為山東省重大科技創新工程項目，本項目將以山東第一醫科大學濟南校區的山東省藥物研究院為核心，落實注冊人制度，依托循環腫瘤細胞檢測鑒定核心診斷技術，進一步注冊鑒定診斷試劑盒，以包括PD1、PD-L1、ER、PR、Her-2、GPC-3、VEGF、P53、Vimentin、TKI-EGFR、RAS、CK、ALK-D5F3、CD20、ALK/EML4、Beta-catenin、E-Cadherin、EP-CAM、HPV、IDH-1、PSA、PSMA、VEGF、GFAP、細胞角蛋白、AE1/AE3、雌激素受體、孕激素受體、BCA-225、CA 125、CEA、EMA、ERCC1、HPV、Ki-67、P53、TOP2A等作為CTCs表達的示蹤劑，注冊超靈敏、超快速、高覆蓋、低成本、準確特異的鑒定診斷試劑盒，通過與在濟南注冊的山東祺欣生物科技有限公司、山東喻曉生物科技有限公司、濟南杏恩生物科技有限公司、山東發現生物技術有限公司合作進行產業化推廣。

發明內容

針對現有技術中存在問題，本發明提供了一種通過外周血循環腫瘤細胞檢測結直腸癌患者BRAF基因V600E突變的方法非診斷目的的檢測方法：利用膜過濾裝置分離獲得無法獲取組織標本的術后結直腸癌患者外周血中的CTC，進一步運用免疫組化技術檢測CTC的BRAF基因V600E表達情況。

本發明采用的技術方案如下：

一種檢測結直腸癌患者外周血循環腫瘤細胞BRAF基因V600E突變的試劑盒，包括稀釋液45mL、脫色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、鼠抗人BRAFV600E突變蛋白單克隆抗體（一抗）、山羊抗鼠 IgG/HRP 100μL、0.1% Triton X-100 100μL、0.3% H₂O₂ 100μL、試劑A、試劑B、6×PBS緩沖液 60mL。