[發(fā)明專利]通過外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測結(jié)直腸癌患者BRAF基因V600E突變的非診斷目的方法

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• 申請日: 2020-04-21
• 公開（公告）號: CN111521797A
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李勝;黃寧;劉智鴻;李浩
• 申請（專利權(quán)）人: 山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;C12N5/09
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 李桂存

1.一種檢測結(jié)直腸癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞BRAF基因V600E突變的試劑盒，其特征在于，包括稀釋液45mL、脫色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、鼠抗人BRAFV600E突變蛋白單克隆抗體、山羊抗鼠 IgG/HRP 100μL、0.1% Triton X-100 100μL、0.3% H₂O₂ 100μL、試劑A、試劑B、6×PBS緩沖液 60mL。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述稀釋液是由1mmol/L EDTA+1mmol月硅酸鹽+0.1% BSA+0.2%泊洛沙姆組成。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述脫色液是由95%酒精與100%二甲苯按容積比1:1組成。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述染色液A為DAB染色液；所述染色液B為蘇木素染色液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑A為乙醇和甲醛按照體積比3：1組成；所述試劑B為二甲苯。

6.一種利用權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的試劑盒非診斷目的檢測結(jié)直腸癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞BRAF基因V600E突變的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）利用膜過濾裝置分離獲取無法獲得組織標(biāo)本的癌患者外周血中的CTC：采集無法獲取組織標(biāo)本結(jié)直腸癌患者外周血：肘正中靜脈外周血5ml；

（2）外周血樣預(yù)處理：將采集的外周血樣采用稀釋液進(jìn)行10倍稀釋，稀釋后加多聚甲醛固定外周血樣10分鐘，固定終濃度為0.25%；

（3）利用膜過濾分離腫瘤細(xì)胞裝置過濾外周血樣，分離獲得外周血CTC：將預(yù)處理的外周血樣加入到膜過濾分離腫瘤細(xì)胞裝置的血樣容器中，使其依靠重力自然過濾；

（4）過濾結(jié)束后，從膜過濾分離腫瘤細(xì)胞裝置中取下濾器，將循環(huán)腫瘤細(xì)胞染色液A液0.5ml加入到濾器中，染色3min，PBS緩沖液沖洗干凈；濾液過濾完全后加入染色液B液1ml，染色2min，純水1ml沖洗2次，取下濾膜，放置在載玻片上，干燥后在顯微鏡下觀察，確定是否存在CTC；

（5）運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測CTC的BRAF基因V600E表達(dá)情況。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測CTC的BRAF基因V600E表達(dá)的具體方法如下：

（1）脫色：將帶有CTC的濾膜從載玻片上取下，置于脫色液中浸泡4-6小時(shí)，脫去CTC染色液；

（2）滴加100μl 0.1% Triton X-100，室溫孵育15min，DI水洗2min×3次；

（3）滴加100μl 0.3% H₂O₂，室溫孵育10min，PBS洗2min×3次；

（4）滴加100μl 鼠抗人BRAFV600E突變蛋白單克隆抗體，室溫孵育2h或4℃過夜，PBS洗2min×3次；

（5）滴加100μl山羊抗鼠 IgG/HRP，18～26℃溫度下孵育20min，PBS洗2min×3次；

（6）滴加100μl DAB顯色液，18～26℃孵育并隨時(shí)在顯微鏡下觀察顯色情況，觀察時(shí)間為3～10min；

（7）顯色完成后，棄掉DAB顯色液，流水沖洗5min，蘇木素染色5min；

（8）鹽酸酒精分化8秒，自來水返藍(lán)5min；

（9）將返藍(lán)后的CTC采用75%乙醇，95%乙醇，100%乙醇梯度乙醇脫水，然后加入0.5mL試劑A，振蕩均勻后，加入1mL試劑B，搖動(dòng)混合均勻后，離心沉淀，將沉淀物采用中性樹脂封固；

（10）光學(xué)顯微鏡下鏡檢。