[發明專利]一種檢測非小細胞肺癌患者外周血循環腫瘤細胞PD-L1基因突變的試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202010316944.5
• 申請日: 2020-04-21
• 公開（公告）號: CN111521795A
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發明（設計）人: 李勝;王振丹;李浩;黃寧;高德海;馬瑩
• 申請（專利權）人: 山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;C12N5/09
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

本發明提供了一種檢測非小細胞肺癌患者外周血循環腫瘤細胞PD?L1基因突變的試劑盒及檢測方法，屬于分子生物學技術領域。該試劑盒包括稀釋液、脫色液、染色液A、染色液B 1mL、PD?L1（人）一抗、山羊抗人IgG/HRP L、0.1%Triton X?100、0.3%H₂O₂、試劑A、試劑B、6×PBS緩沖液。本發明提供的檢測方法，不用穿刺活檢獲取組織標本即可檢測到晚期或復發非小細胞肺癌患者PD?L1表達情況。該技術屬于微創，并能夠實時檢測。能夠避免染色過程中可能產生的邊緣效應導致的假陽性結果，穩定性好，降低細胞的損失，提高檢測的準確性。

技術領域

本發明提供了一種檢測非小細胞肺癌患者外周血循環腫瘤細胞PD-L1基因突變的試劑盒及檢測方法，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

肺癌是導致癌癥患者死亡的主要惡性腫瘤之一，在我國，肺癌的發病率和死亡率均居第一位。非小細胞肺癌（NSCLC）約占全部肺癌的85%，而這其中超過70%的NSCLC患者在確診時已為晚期。盡管手術和放化療等治療技術不斷提高，NSCLC患者5年生存率仍低于20%，主要死因包括局部復發與遠處轉移。

循環腫瘤細胞（Circulating tumor cell，CTC）是從實體腫瘤脫落進入外周血液循環的腫瘤細胞，自1989年被發現以來，目前已有多種方法用于外周血循環腫瘤細胞的檢測。近期研究表明，其檢測對于評估腫瘤患者尤其是晚期腫瘤患者的預后以及選擇合適的個體化治療具有重要的臨床意義。因CTC檢測具有微創、實時檢測等特點，被稱為腫瘤的“液態活檢”。

隨著分子生物學的發展，PD-1/PD-L1為免疫靶點的免疫療法為非小細胞肺癌治療帶來了新的曙光。研究發現，免疫抑制與免疫逃逸和腫瘤細胞PD-L1的過表達密切相關，腫瘤細胞可通過其表面的PD-L1與免疫細胞T細胞表面的PD-1結合，傳導抑制性信號，使得T細胞不能識別腫瘤細胞和向腫瘤細胞發出攻擊信號，導致了腫瘤細胞免疫逃逸。基于此理論提出假設，自原發灶脫落進入循環系統的循環腫瘤細胞(CTC)出現凋亡、免疫清除或存活、轉移結局與PD-L1表達密切相關。PD-1或PD-L1免疫制劑的療效多與腫瘤組織中PD-L1的免疫組化表達水平有關，提示PD-L1表達水平可能是預測PD-1免疫治療療效的生物標志物；還有研究表明非小細胞肺癌組織中PD-L1的高表達與腫瘤侵襲性呈正相關。經文獻檢索發現，目前乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌、肝癌應用不同的檢測方法對循環腫瘤細胞(CTC)PD-L1表達檢測有少量報道，但非小細胞肺癌循環腫瘤細胞PD-L1的檢測國內外均未見報道。因此，檢測循環腫瘤細胞(CTC)PD-L1表達情況對非小細胞肺癌預后及免疫治療療效評估具有重要價值。

目前，山東省第一醫科大學、山東省藥物研究院聯合山東祺欣生物科技有限公司、山東喻曉生物科技有限公司、濟南杏恩生物科技有限公司、山東發現生物技術有限公司等單位，對于循環腫瘤細胞檢測鑒定關鍵技術進行產業化推廣的研究，本項目為山東省重大科技創新工程項目，本項目將以山東第一醫科大學濟南校區的山東省藥物研究院為核心，落實注冊人制度，依托循環腫瘤細胞檢測鑒定核心診斷技術，進一步注冊鑒定診斷試劑盒，以包括PD1、PD-L1、ER、PR、Her-2、GPC-3、VEGF、P53、Vimentin、TKI-EGFR、RAS、CK、ALK-D5F3、CD20、ALK/EML4、Beta-catenin、E-Cadherin、EP-CAM、HPV、IDH-1、PSA、PSMA、VEGF、GFAP、細胞角蛋白、AE1/AE3、雌激素受體、孕激素受體、BCA-225、CA 125、CEA、EMA、ERCC1、HPV、Ki-67、P53、TOP2A等作為CTCs表達的示蹤劑，注冊超靈敏、超快速、高覆蓋、低成本、準確特異的鑒定診斷試劑盒，通過與在濟南注冊的山東祺欣生物科技有限公司、山東喻曉生物科技有限公司、濟南杏恩生物科技有限公司、山東發現生物技術有限公司合作進行產業化推廣。

發明內容