[發明專利]一種檢測非小細胞肺癌患者外周血循環腫瘤細胞PD-L1基因突變的試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202010316944.5
• 申請日: 2020-04-21
• 公開（公告）號: CN111521795A
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發明（設計）人: 李勝;王振丹;李浩;黃寧;高德海;馬瑩
• 申請（專利權）人: 山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;C12N5/09
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

1.一種檢測非小細胞肺癌患者外周血循環腫瘤細胞PD-L1基因突變的試劑盒，其特征在于，包括稀釋液45mL、脫色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、PD-L1（人）一抗100μL、山羊抗人 IgG/HRP 100μL、0.1% Triton X-100 100μL、0.3% H₂O₂ 100μL、試劑A 0.5mL、試劑B1mL、6×PBS緩沖液 60mL；所述PBS緩沖液的pH值為7.4。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述稀釋液是由1mmol/L EDTA+0.1%BSA+0.1%海藻糖+0.2%聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物組成，所述基礎液為Tris-HCl緩沖劑。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述脫色液是由95%酒精與100%二甲苯按容積比1:1組成。

4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述染色液A為DAB染色液；所述染色液B為蘇木素染色液。

5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑A為0.6%的羥丙基甲基纖維素水溶液；所述試劑B為乙醇和1，2-丙二醇按照體積比3：1組成。

6.一種利用權利要求1-5任一項所述的試劑盒非診斷目的檢測非小細胞肺癌患者外周血循環腫瘤細胞PD-L1基因突變的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）利用膜過濾裝置分離獲取無法獲得組織標本的晚期或復發非小細胞肺癌患者外周血中的CTC：采集無法獲取組織標本的晚期或復發非小細胞肺癌患者外周血：肘正中靜脈外周血5ml；

（2）外周血樣預處理：將采集的外周血樣采用稀釋液進行10倍稀釋，稀釋后加多聚甲醛固定外周血樣10分鐘，固定終濃度為0.25%；

（3）利用膜過濾分離腫瘤細胞裝置過濾外周血樣，分離獲得外周血CTC：將預處理的外周血樣加入到膜過濾分離腫瘤細胞裝置的血樣容器中，使其依靠重力自然過濾；

（4）過濾結束后，從膜過濾分離腫瘤細胞裝置中取下濾器，將循環腫瘤細胞染色液A液0.5ml加入到濾器中，染色3min，PBS緩沖液沖洗干凈；濾液過濾完全后加入染色液B液1ml，染色2min，純水1ml沖洗2次，取下濾膜，放置在載玻片上，干燥后在顯微鏡下觀察，確定是否存在CTC；

（5）運用免疫組化技術檢測CTC的PD-L1表達情況。

7.根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測CTC的PD-L1表達的具體方法如下：

（1）脫色：將帶有CTC的濾膜從載玻片上取下，置于脫色液中浸泡4-6小時，脫去CTC染色液；

（2）滴加100μl 0.1% Triton X-100，室溫孵育15min，DI水洗2min×3次；

（3）滴加100μl 0.3% H₂O₂，室溫孵育10min，PBS洗2min×3次；（4）滴加100μlPD-L1（人）一抗，室溫孵育2h或4℃過夜，PBS洗2min×3次；

（5）滴加100μl山羊抗人 IgG/HRP，18～26℃溫度下孵育20min，PBS洗2min×3次；

（6）滴加100μl DAB顯色液，18～26℃孵育并隨時在顯微鏡下觀察顯色情況，觀察時間為3～10min；

（7）顯色完成后，棄掉DAB顯色液，流水沖洗5min，蘇木素染色5min；

（8）鹽酸酒精分化8秒，自來水返藍5min；

（9）將返藍后的CTC采用75%乙醇（1min），95%乙醇（1min），100%乙醇（1min）梯度乙醇脫水，然后加入0.5mL試劑A，振蕩均勻后，加入1mL試劑B，搖動混合均勻后，離心沉淀，將沉淀物采用中性樹脂封固；

（10）光學顯微鏡下鏡檢。