[發明專利]一種基于DNA網狀結構靈敏檢測miRNA的方法

有效

• 申請號: 202010316939.4
• 申請日: 2020-04-21
• 公開（公告）號: CN111575353B
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發明（設計）人: 劉海云;高奕;何濤;顏梅;于京華
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 趙鳳

本專利公開了一種基于DNA網狀結構靈敏檢測miRNA的方法，涉及生物傳感領域。通過設計結構可切換的啞鈴型探針，提高了目標識別的特異性，同時又使得滾環擴增產物具有串聯重復莖環結構的特點；滾環擴增產物與修飾DNA?AuNPs雜交形成DNA網狀結構，使得AuNPs發生聚集，利用動態光散射技術對AuNPs尺寸進行測量，從而實現miRNA的檢測。本發明靈敏度高、特異性好。

技術領域

本發明涉及動態光散射技術檢測領域，更具體地說是一種以核酸滾環擴增技術為基礎構建DNA網狀結構，誘導納米粒子由單分散到聚集狀態，利用動態光散射技術檢測納米粒子粒徑，進而實現檢測miRNA的方法。

背景技術

MicroRNA（miRNA）目前是一個十分活躍的研究領域，它對于深入探討生命現象的本質、解釋細胞行為和疾病發生機制、以及疾病診斷、基因治療藥物的開發都具有重大意義。miRNA廣泛存在于各種動、植物中，參與多種重要的生命活動。它作為基因調控的重要調控因子，在許多生物學過程中發揮著重要作用，但它的調控范圍并不僅限于正常的生理活動，還與許多腫瘤、癌癥的發生有著密切的聯系。

MiRNA被視為一種新型的生物標志物和各種疾病的潛在治療靶標。它的廣泛存在與進化上的保守性，暗示它在生命活動中具有必不可少的調節作用，他們參與動植物生長發育、細胞分化、細胞增殖與調亡、激素分泌、腫瘤形成等各種過程。MiRNA無論在數量上還是功能上，可能都遠遠超過目前的發現，因此miRNA的檢測成為當前研究的熱點和前沿。然而，由于miRNA固有的易降解和低豐度的特點，使得難以高靈敏的檢測miRNA。

為了解決miRNA在低濃度下也能被檢測的問題，miRNA的識別和信號放大檢測策略變得尤為重要。然而，目前常見的miRNA檢測方法，例如熒光比色法、熒光法、化學發光法等光學檢測方法靈敏度不高且易受光穩定性和復雜生物樣品的影響。因此發展一種既穩定又能高靈敏的檢測miRNA的方法具有重要意義。本實驗試圖開發一種靈敏穩定的方法，設計結構可切換的啞鈴型探針，利用滾環擴增技術構建DNA網狀結構，利用穩定的動態光散射技術實現miRNA的高靈敏檢測。

發明內容

本發明要解決的技術問題是通過滾環擴增技術構建DNA網狀結構實現miRNA的高靈敏檢測。

一種基于DNA網狀結構靈敏檢測miRNA的方法，其特征是包括以下步驟：

（1）探針設計

根據目標鏈序列設計相應的掛鎖探針PP、修飾金納米粒子（AuNPs）的DNA序列；其中，啞鈴型掛鎖探針PP序列的5端修飾了磷酸基團，修飾AuNPs的DNA序列的3端修飾了巰基（C₆-SH）；

（2）啞鈴型掛鎖探針PP的連接

啞鈴型掛鎖探針PP的連接反應在10 μL溶液體積中進行，其中包10 μM掛鎖探針PP，2 μL 10×T4 DNA連接酶反應緩沖液，1 μM目標miRNA，20 U/μL T4 DNA連接酶和5 μL的DEPC處理水，加入T4 DNA連接酶之前，將反應混合物在55°C下加熱5分鐘，然后在39°C退火30分鐘，冷卻至室溫，然后加入T4 DNA連接酶，在16°C下進行連接反應2小時；

（3）滾環擴增反應

向（2）步驟中得到的溶液中加入2.5 μL 10×phi29 DNA聚合酶反應緩沖液，0.5 μL BSA，3 μL濃度為25 mM的dNTPs，1 μL的phi29 DNA聚合酶和8 μL的DEPC處理水；所得混合物在30°C下反應6小時，然后在65°C下孵育10分鐘終止反應；

（4）動態光散射技術檢測

向（3）步驟中得到的溶液中加入10 μL DNA-AuNPs，將混合液在37°C孵化30分鐘；然后進行動態光散射測量，實驗參數如下：25 °C，平衡穩定時間10秒和測量角度90°。