[發明專利]一種基于DNA網狀結構靈敏檢測miRNA的方法

有效

• 申請號: 202010316939.4
• 申請日: 2020-04-21
• 公開（公告）號: CN111575353B
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發明（設計）人: 劉海云;高奕;何濤;顏梅;于京華
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 趙鳳

1.一種基于DNA網狀結構靈敏檢測let-7a miRNA的方法，其特征是包括以下步驟:

(1)探針設計

根據目標鏈序列設計相應的啞鈴型掛鎖探針 PP、修飾AuNPs 的 DNA序列;其中，啞鈴型掛鎖探針PP序列的5’端修飾了磷酸基團，修飾AuNPs的DNA序列的3’端修飾了巰基C6-SH;

(2)啞鈴型掛鎖探針PP的連接

啞鈴型掛鎖探針PP的連接反應在10μL溶液體積中進行，其中包括10μM掛鎖探針 PP，2μL10XT4 DNA連接酶反應緩沖液，1μMlet-7a，20U/μLT4DNA連接酶和5μL的DEPC 處理水，加入T4DNA連接酶之前，將反應混合物在55°C下加熱5分鐘，然后在39°C退火30分鐘，冷卻至室溫，然后加入 T4 DNA連接酶，在16°C下進行連接反應2小時;

(3)滾環擴增反應

向(2)步驟中得到的溶液中加入2.5 uL10xphi29 DNA 聚合酶反應緩沖液，0.5 μLBSA，3μL濃度為25mM的dNTPs，1μL的phi29DNA聚合酶和8μL的DEPC處理水;所得混合物在30°C下反應6小時，然后在65°C下孵育10分鐘終止反應;

(4) 動態光散射技術檢測

向(3)步驟中得到的溶液中加入10μLDNA-AuNPs，將混合液在37°C孵化30分鐘;然后進行動態光散射測量，實驗參數如下:25°C，平衡穩定時間 10秒和測量角度 90°；所述啞鈴型掛鎖探針 PP序列如核酸序列表中序列一所示，所述修飾AuNPs 的 DNA序列如核酸序列表中序列二所示，所述let-7a miRNA序列如核酸序列表中序列三所示。

2.根據權利要求1所述一種基于DNA網狀結構靈敏檢測 miRNA 的方法，其特征在于，具有串聯莖環結構的滾環擴增產物與DNA-AuNPs雜交，形成DNA網狀結構，使得AuNPs由分散到聚集，尺寸由小變大。

3.根據權利要求1所述一種基于DNA網狀結構靈敏檢測miRNA 的方法，其特征在于，啞鈴型的掛鎖探針以自身為模板連接成為啞鈴型的密封探針，只有目標miRNA 存在時，通過鏈置換反應才能將密封探針從啞鈴型活化成圓形，從而啟動滾環擴增反應。