[發明專利]一種將寡聚核苷酸逆轉錄成cDNA的方法及寡聚核苷酸檢測方法

有效

• 申請號: 202010316713.4
• 申請日: 2020-04-21
• 公開（公告）號: CN111500676B
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發明（設計）人: 秦少偉;趙利峰;李才林
• 申請（專利權）人: 桂林旅游學院
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6851;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京冠榆知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11666
• 代理人: 王道川

本發明一種將寡聚核苷酸逆轉錄成cDNA的方法及寡聚核苷酸檢測方法，包括如下步驟：(1)設計單鏈DNA，單鏈DNA的中間部分與目標寡聚核苷酸堿基互補；(2)根據目標寡聚核苷酸選擇上游輔助RNA和下游輔助RNA，且上游輔助RNA的3’端含有羥基，下游輔助RNA的5’端含有單磷酸基團；單鏈DNA的兩端分別與上游輔助RNA和下游輔助RNA堿基互補；(3)利用T4DNA連接酶將目標寡聚核苷酸兩端分別與上游輔助RNA和下游輔助RNA連接起來；(4)將單鏈DNA消化掉，得到中間部分為目標寡聚核苷酸的待逆轉錄單鏈RNA；(5)在待逆轉錄單鏈RNA的3’端設計引物，將待逆轉錄單鏈RNA逆轉錄成cDNA。不僅能夠檢測10nt以上的核苷酸，特別是能夠檢測6?10nt長的小片段核苷酸。

技術領域

本發明涉及RNA檢測技術領域。具體地說是一種將寡聚核苷酸逆轉錄成cDNA的方法及寡聚核苷酸檢測方法。

背景技術

生物體內天然存在片段長度小于10個nt的寡聚核苷酸，如轉錄起始時產生的流產性轉錄本(Abortive transcript,AT)和長片段核苷酸降解后產生的小片段核苷酸)。現有發現暗示這些小片段核苷酸在體內可能有重要的生物學作用，但對10nt以下的小片段核苷酸一直無法進行定性和定量檢測。

發明內容

為此，本發明所要解決的技術問題在于提供一種將寡聚核苷酸逆轉錄成cDNA的方法及寡聚核苷酸檢測方法，不僅能夠檢測10nt以上的核苷酸，特別是能夠檢測6-10nt長的小片段核苷酸。

為解決上述技術問題，本發明提供如下技術方案：

一種將寡聚核苷酸逆轉錄成cDNA的方法，包括如下步驟：

(1)設計單鏈DNA，所述單鏈DNA的中間部分與目標寡聚核苷酸堿基互補；

(2)根據目標寡聚核苷酸選擇上游輔助RNA和下游輔助RNA，且所述上游輔助RNA的3’端含有單羥基，所述下游輔助RNA的5’端含有單磷酸基團；所述單鏈DNA的兩端分別與所述上游輔助RNA和所述下游輔助RNA堿基互補；

(3)將目標寡聚核苷酸兩端分別與所述上游輔助RNA和所述下游輔助RNA連接起來；

(4)將所述單鏈DNA消化掉，得到中間部分為目標寡聚核苷酸的待逆轉錄單鏈RNA；

(5)在待逆轉錄單鏈RNA的3’端設計引物，將待逆轉錄單鏈RNA逆轉錄成cDNA。

上述將寡聚核苷酸逆轉錄成cDNA的方法，在步驟(3)中：用連接酶將目標寡聚核苷酸兩端分別與所述上游輔助RNA和所述下游輔助RNA連接起來。

上述將寡聚核苷酸逆轉錄成cDNA的方法，在步驟(3)中：所述連接酶為T4 DNA連接酶。

上述將寡聚核苷酸逆轉錄成cDNA的方法，在步驟(1)中：用DNase I將所述單鏈DNA消化掉。

寡聚核苷酸檢測方法，包括如下步驟：

(A)按照權利要求1-6任一所述的方法，將寡聚核苷酸逆轉錄成cDNA；

(B)對cDNA進行qPCR定量檢測、高通量測序檢測或基因芯片檢測，從而可以對體內產生的寡聚核苷酸進行qPCR定量檢測、高通量測序檢測或基因芯片檢測。

上述寡聚核苷酸檢測方法，在步驟(B)中，qPCR定量檢測方法如下：

第一種方法：根據cDNA設計上游引物Primer F和下游引物Primer R，上游引物Primer F與待逆轉錄單鏈RNA的上游端相同，下游引物Primer R與待逆轉錄單鏈RNA的下游端堿基互補，然后進行實時定量PCR檢測；