[發(fā)明專利]一種將寡聚核苷酸逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的方法及寡聚核苷酸檢測方法

有效

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• 申請日: 2020-04-21
• 公開（公告）號: CN111500676B
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 秦少偉;趙利峰;李才林
• 申請（專利權(quán)）人: 桂林旅游學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6851;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京冠榆知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11666
• 代理人: 王道川

1.一種將寡聚核苷酸逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)設(shè)計單鏈DNA，所述單鏈DNA的中間部分與目標(biāo)寡聚核苷酸堿基互補；

(2)根據(jù)目標(biāo)寡聚核苷酸選擇上游輔助RNA和下游輔助RNA，且所述上游輔助RNA的3’端含有單羥基，所述下游輔助RNA的5’端含有單磷酸基團；所述單鏈DNA的兩端分別與所述上游輔助RNA和所述下游輔助RNA堿基互補；上游輔助RNA和下游輔助RNA的長度分別為35bp；

(3)將目標(biāo)寡聚核苷酸兩端分別與所述上游輔助RNA和所述下游輔助RNA連接起來；目標(biāo)寡聚核苷酸為流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本AT；將5′端只有一個磷酸基團的長鏈RNA去除磷酸基團，從而使所有降解產(chǎn)生的寡聚核苷酸不能在后續(xù)步驟中被連接起來，然后再將5′端有3個磷酸的流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本去掉兩個磷酸基團，以便下一步只將AT與輔助RNA連接起來；流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本AT的3’端含有單羥基；

(4)將所述單鏈DNA消化掉，得到中間部分為目標(biāo)寡聚核苷酸的待逆轉(zhuǎn)錄單鏈RNA；

(5)在待逆轉(zhuǎn)錄單鏈RNA的3’端設(shè)計引物，將待逆轉(zhuǎn)錄單鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；

在步驟(3)中：用連接酶將目標(biāo)寡聚核苷酸兩端分別與所述上游輔助RNA和所述下游輔助RNA連接起；

在步驟(3)中：所述連接酶為T4 DNA連接酶；

在步驟(1)中：用DNase I將所述單鏈DNA消化掉。

2.非診斷目的的寡聚核苷酸檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

(A)按照權(quán)利要求1所述的方法，將寡聚核苷酸逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；

(B)對cDNA進行qPCR定量檢測、高通量測序檢測或基因芯片檢測，從而可以對體內(nèi)產(chǎn)生的寡聚核苷酸進行qPCR定量檢測、高通量測序檢測或基因芯片檢測。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的非診斷目的的寡聚核苷酸檢測方法，其特征在于，在步驟(B)中，qPCR定量檢測方法如下：

第一種方法：根據(jù)cDNA設(shè)計上游引物Primer F和下游引物Primer R，上游引物PrimerF與待逆轉(zhuǎn)錄單鏈RNA的上游端相同，下游引物Primer R與待逆轉(zhuǎn)錄單鏈RNA的下游端堿基互補，然后進行實時定量PCR檢測；

第二種方法：設(shè)計Taqman-MGB探針，Taqman-MGB探針覆蓋待逆轉(zhuǎn)錄單鏈RNA中目標(biāo)寡聚核苷酸及其兩端若干個堿基序列，用高特異的Taqman探針PCR法檢測目標(biāo)寡聚核苷酸的含量。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的非診斷目的的寡聚核苷酸檢測方法，其特征在于，在步驟(B)中：高通量測序檢測方法如下：

(B1-1)根據(jù)cDNA設(shè)計上游引物Primer F和下游引物Primer R，然后用上游引物PrimerF和下游引物Primer R對cDNA進行第一輪PCR；

(B1-2)設(shè)計包含Primer F的上游引物，其包括用于和illumina測序儀結(jié)合和cluster形成的p5序列以及用于read1的測序的i5序列，i5序列位于p5序列和Primer F之間；同時設(shè)計包含Primer R的下游引物，其包括用于和illumina測序儀結(jié)合和cluster形成的p7序列、用于read2的測序的i7序列、以及位于p7序列和i7序列之間的barcode序列，并且i7序列位于barcode序列和Primer R之間；barcode序列用來區(qū)分樣品。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的非診斷目的的寡聚核苷酸檢測方法，其特征在于，在步驟(B)中，基因芯片檢測方法如下：在上游輔助RNA和下游輔助RNA上設(shè)計限制性核酸內(nèi)切EcoR V的酶切位點，在完成PCR擴增后，用EcoR V處理PCR產(chǎn)物，就會產(chǎn)生包含目標(biāo)寡聚核苷酸序列的DNA片段，然后設(shè)計相應(yīng)的探針，最后進行檢測。