[發明專利]一種提高納豆芽孢桿菌高效生物合成維生素K2

在審

• 申請號: 202010315201.6
• 申請日: 2020-04-21
• 公開（公告）號: CN111349639A
• 公開（公告）日: 2020-06-30
• 發明（設計）人: 張廣華;劉云;陳立軍;區文彩;阮月敏;陸陽
• 申請（專利權）人: 西寶生物科技（上海）股份有限公司
• 主分類號: C12N15/67
• 分類號: C12N15/67;C12N15/75;C12P7/66;C12R1/07
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種提高納豆芽孢桿菌高效生物合成維生素K₂(MK-7)的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1：啟動子文庫的構建；

步驟2：含不同啟動子序列載體的獲得；

步驟3：混合質粒的轉化；

步驟4：重組菌株熒光強度的檢測；

步驟5：同源重組片段的構建；

步驟6：重組P_mytxM啟動子納豆芽孢桿菌的構建；

步驟7：重組P_mgapA啟動子納豆芽孢桿菌的構建；

步驟8：重組P_maroK啟動子納豆芽孢桿菌的構建；

步驟9：利用重組P_ytxM,P_gapA和P_aroK啟動子菌株發酵生產維生素K₂(MK-7)。

2.如權利要求1所述的提高納豆芽孢桿菌高效生物合成維生素K₂(MK-7)的方法，其特征在于，所述步驟1包括隨機突變啟動子片段獲得和融合片段的獲得，其中隨機突變啟動子片段獲得包括如下步驟：

以納豆芽孢桿菌基因組為模板，采用引物ytxMF和ytxMR以及QuicK Mutation基因隨機突變試劑盒擴增ytxM基因的上游啟動子序列ytxM，得到ytxM不同序列的混合啟動子片段PytxM，采用gapAF和gapAR引物用上述方法可以獲得PgapA，采用aroKF和aroKR引物用上述方法可以獲得aroK不同序列的混合啟動子片段ParoK。

3.如權利要求1所述的提高納豆芽孢桿菌高效生物合成維生素K₂(MK-7)的方法，其特征在于，所述步驟2包括如下步驟：

將含有eGFP的載體pJYW-4采用引物ZTytxMF,ZTytxMR；ZTgapAF,ZgapAR和ZTaroKF，ZTaroKR分別線性化，得到線性化載體片段ZTytxM,ZTgapA，ZTaroK，將載體片段與得到的混合啟動子片段分別連接后轉化大腸桿菌JM109，提取混合質粒。

4.如權利要求1所述的提高納豆芽孢桿菌高效生物合成維生素K₂(MK-7)的方法，其特征在于，所述步驟3包括將權利要求2中得到的混合質粒分別轉化到納豆芽孢桿菌感受態細胞中，具體步驟為：

新鮮平板挑單菌落接種于2ml LB培養基中，過夜培養，當其OD₆₀₀＝0.2時轉接到50ml的LB培養集中，并加入0.5M山梨醇，37℃、200rpm培養到OD₆₀₀＝1.2；

用冷凍離心機4℃下，7000rpm/min離心5min，將收集的菌體使用預冷的電擊緩沖液進行洗滌，再離心，反復三次；

最終使用將菌體用預冷的電擊緩沖液懸浮后，分裝于1.5ml離心管中，每個離心管中分裝50μL感受態細胞，每個感受態細胞中加入質粒濃度為1000～2000ng/μL；

將上述混合好的感受態冰浴孵育5min，加入預冷的電轉杯中，電擊一次，電轉儀設置：0.5～1.0Kv，25μF200Ω，1mm,電擊2次，電擊完畢立即加入1ml復蘇培養基，37℃，200rpm，復蘇3h后，涂板，過夜培養；

挑選平板上長出的單菌落，利用引物tyxMYZF，ytxMYZR進行菌落PCR驗證，替換后擴增得到的片段長度為800bp，并進行測序。

5.如權利要求1所述的提高納豆芽孢桿菌高效生物合成維生素K₂(MK-7)的方法，其特征在于，所述步驟4包括如下步驟：

挑取測序正確的菌株各10株，進行96淺孔板培養37℃培養12h，采用酶標儀在523nm處檢測每個重組菌株發酵液的熒光強度，提取RNA檢測相對轉錄強度。