[發明專利]一種提高納豆芽孢桿菌高效生物合成維生素K2

在審

• 申請號: 202010315201.6
• 申請日: 2020-04-21
• 公開（公告）號: CN111349639A
• 公開（公告）日: 2020-06-30
• 發明（設計）人: 張廣華;劉云;陳立軍;區文彩;阮月敏;陸陽
• 申請（專利權）人: 西寶生物科技（上海）股份有限公司
• 主分類號: C12N15/67
• 分類號: C12N15/67;C12N15/75;C12P7/66;C12R1/07
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• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種提高納豆芽孢桿菌高效生物合成維生素K₂(MK?7)的方法，屬于遺傳工程技術領域。本發明是采用易錯PCR和CRISPR?Cas9基因編輯技術，通過對維生素K₂(MK?7)生物合成途徑相關基因ytxM、gapA和aroK啟動子的突變篩選和整合，構建得到27株重組菌BN3?1～BN3?27，篩選得到高產菌，產量達到了133g/l，是原始菌株的的產量的5.78倍，為進一步代謝工程改造納豆芽孢桿菌生產維生素K₂(MK?7)奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及遺傳工程技術領域，特別涉及一種提高納豆芽孢桿菌高效生物合成維生素K₂(MK-7)的方法。

背景技術

維生素K₂(MK-7)[本文中簡稱MK-7]，又稱七烯甲萘醌，英文名稱：Menaquinone-7，CAS No.：2124-57-4，是維生素K的活性體之一，是由一個甲基萘醌母環和七個異戊二烯側鏈連接而成，是一類重要的脂溶性維生素，是維生素K₂中的一種，MK-7作為γ-谷氨酸羧化酶的輔因子，具有半衰期長，生物利用度好的特點。具有顯著的治療和預防骨質疏松(促進骨礦化、促進骨形成、抑制骨鈣流失)，抗動脈鈣化及骨關節炎，抗腫瘤，抗氧化、延緩衰老、美膚養顏，治療肝炎，調整消化道的活動，緩解平滑肌的痙攣，預防肝硬化進展為肝癌，治療維生素K₂缺乏性出血癥，利尿、強肝解毒，降低血壓等功效，目前MK-7得到了食品保健、制藥行業的廣泛關注，具有很高的市場應用價值。

納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)是一種好氧型革蘭氏陽性益生菌，屬細菌科、芽孢桿菌屬，是枯草芽孢桿菌的一個亞種，具有較強的抗逆性，在熱、酸堿的條件下能保持其穩定性。納豆芽孢桿菌可以分解大分子物質生產具有重要用途的氨基酸，有機酸等，自身代謝能分泌多種維生素和消化酶，是生產MK-7優秀的底盤微生物。許靜等人利用細菌原生質體電容和技術篩選出維生素K₂突變菌BKU-6，其維生素K₂達到39.6mg/L。Sato等人篩選出一株具有二苯胺抗性的MK-7產生菌MH-1，并以大豆抽提物和甘油為主要營養物質，經過5天的靜置培養，最終MK-7產量達到60mg/L。我國對納豆芽孢桿菌功能特性的研究還處于實驗小規模研究階段，所以開發具有工業化生產的納豆芽孢桿菌具有重要的意義。

目前合成MK-7的方法有化學合成法和微生物合成法，化學合成的七稀甲萘醌(MK-7)分子中的異戊二烯側鏈多為順式結構，活性和功能具有很大的限制，且副產物多，原料來源受到限制，已經逐步被生物發酵法所替代。微生物合成法主要集中在兩種菌株的研究，分別是納豆芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，但原始的枯草芽孢桿菌的MK-7產量較低(10mg/L)，作為生產MK-7的底盤微生物時，產量提高有局限。而作為從富含MK-7的納豆中篩選出的納豆芽孢桿菌作為底盤微生物，其原始菌的MK-7產量較為可觀(20mg/L)。因此對納豆芽孢桿菌進行代謝改造對于提高MK-7的產量具有積極意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種提高納豆芽孢桿菌高效生物合成維生素K₂(MK-7)的方法，對納豆芽孢桿菌進行代謝通路改造，利用隨機突變試劑盒對納豆芽孢桿菌合成MK-7的中的gapA、aroK和ytxM關鍵基因啟動子序列進行突變，進一步提高MK-7的產量，獲得和篩選出高產MK-7產量的納豆芽孢桿菌。經過發酵驗證后最終納豆芽孢桿菌發酵生產七烯甲萘醌在搖瓶培養的產量達到133mg/L，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種提高納豆芽孢桿菌高效生物合成維生素K₂(MK-7)的方法，包括如下步驟：

步驟1：啟動子文庫的構建；

步驟2：含不同啟動子序列載體的獲得；

步驟3：混合質粒的轉化；