[發(fā)明專利]一種法夫酵母補(bǔ)糖培養(yǎng)基及其進(jìn)行高密度培養(yǎng)的方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010315021.8
• 申請(qǐng)日: 2020-04-21
• 公開（公告）號(hào): CN113528358A
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳克杰;孫新強(qiáng);楊一恭;陳迎迎;周旭燕;邵東;徐作武;王小平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠
• 主分類號(hào): C12N1/16
• 分類號(hào): C12N1/16;C12P23/00;C12R1/645
• 代理公司: 北京乾誠(chéng)五洲知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11042
• 代理人: 付曉青;李廣文

本發(fā)明提供了一種法夫酵母補(bǔ)糖培養(yǎng)基及其進(jìn)行高密度培養(yǎng)的方法和應(yīng)用，所述補(bǔ)糖培養(yǎng)基含有利于細(xì)胞增殖和蝦青素合成的碳源組合，能彌補(bǔ)單一碳源產(chǎn)量低的缺點(diǎn)。所述高密度培養(yǎng)方法用在線活細(xì)胞傳感儀檢測(cè)活細(xì)胞濃度，通過采用指數(shù)補(bǔ)料結(jié)合溶氧反饋脈沖補(bǔ)料(DO?STAT補(bǔ)料)的兩階段補(bǔ)糖策略，達(dá)到解除克勒勃屈利效應(yīng)(Crabtree效應(yīng))和降低副產(chǎn)物乙醇生成的目的，從而實(shí)現(xiàn)法夫酵母細(xì)胞的大量增殖和蝦青素產(chǎn)量的提高。本發(fā)明提供的補(bǔ)糖培養(yǎng)基及高密度培養(yǎng)方法，可大幅提高法夫酵母蝦青素產(chǎn)量水平，在100m³發(fā)酵罐上蝦青素產(chǎn)量為570.0mg/L，適用于商業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種法夫酵母補(bǔ)糖培養(yǎng)基及其進(jìn)行高密度培養(yǎng)的方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

蝦青素(Astaxanthin)是一種含氧類胡蘿卜素，化學(xué)名為3,3′-二羥基-β,β′-胡蘿卜素-4,4′-二酮，分子結(jié)構(gòu)中紫羅酮環(huán)的3和3′位置各含一個(gè)手性(或不對(duì)稱)中心，故可形成3S-3′S、3R-3′S、3R-3′R(也稱為左旋、內(nèi)消旋、右旋)3種對(duì)映異構(gòu)體。蝦青素具有強(qiáng)烈的抗氧化性能，其抗氧化能力是β-胡蘿卜素的10倍，比維生素E強(qiáng)百倍以上，被譽(yù)為“超級(jí)維生素E”，在延緩衰老、提高免疫，防治腫瘤、心血管疾病和糖尿病等方面顯示作用。

法夫酵母(Phaffia rhodozyma)作為最具有商業(yè)化生產(chǎn)潛能的生產(chǎn)菌株，其抽提物被證明具有安全性，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)于2010年增補(bǔ)其用作動(dòng)物飼料添加劑，亦于2013年進(jìn)入中國(guó)農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄》。隨著下游水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，市場(chǎng)對(duì)法夫酵母源蝦青素的需求日益增長(zhǎng)。但法夫酵母生產(chǎn)蝦青素存在諸多問題，焦點(diǎn)在于以生產(chǎn)強(qiáng)度、產(chǎn)量水平和原料成本等為主要經(jīng)濟(jì)技術(shù)指標(biāo)的參數(shù)離商業(yè)化生產(chǎn)差距較大。因此，法夫酵母實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵在于利用基因重組技術(shù)對(duì)細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行修飾、改造來改變細(xì)胞特性，并整合細(xì)胞基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程策略，進(jìn)一步提升蝦青素的生產(chǎn)強(qiáng)度。國(guó)內(nèi)外對(duì)法夫酵母發(fā)酵相關(guān)的技術(shù)研究已相當(dāng)廣泛。公布號(hào)為CN 108913746A的專利公開了在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加番茄粉，通過檸檬酸和NaOH控制pH值4.0～6.0，維持葡萄糖濃度15～35g/L，生物量達(dá)到65.9g/L，蝦青素含量達(dá)到81.76mg/L。肖安風(fēng)等研究了乙醇、乙酸鈉、乳酸鈉、檸檬酸和甘油這5種糖代謝產(chǎn)物對(duì)法夫酵母產(chǎn)蝦青素的影響，認(rèn)為乙酸鈉、乳酸鈉和檸檬酸對(duì)產(chǎn)蝦青素有一定的促進(jìn)作用，當(dāng)乳酸添加量為1g/L時(shí)蝦青素濃度最大達(dá)到1.54mg/L。YU-ICHI YAMANE等研究了氧含量和葡萄糖供應(yīng)對(duì)法夫酵母初級(jí)代謝和蝦青素生產(chǎn)的影響，認(rèn)為呼吸速率與蝦青素生產(chǎn)速率正相關(guān)，與乙醇生產(chǎn)速率負(fù)相關(guān)，并得出高C/N比提高蝦青素的產(chǎn)量，過高葡萄糖濃度將抑制細(xì)胞增殖的結(jié)果，在此基礎(chǔ)上提出細(xì)胞生長(zhǎng)期控制低C/N比，蝦青素生產(chǎn)期控制高C/N比的兩階段補(bǔ)糖方式。倪輝等報(bào)道，自動(dòng)流加調(diào)控pH值比間歇調(diào)控pH值更有利于法夫酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)及蝦青素合成，1m³發(fā)酵罐中試生產(chǎn)生物量及蝦青素產(chǎn)量分別達(dá)到85.11g/L和279.96mg/L。上述相關(guān)研究和技術(shù)雖然對(duì)產(chǎn)量提高起到一定的作用，但存在以下問題：1)未充分考慮Crabtree效應(yīng)對(duì)菌體生長(zhǎng)的深刻影響；2)僅從單一因素的碳源、促進(jìn)劑或環(huán)境因子等進(jìn)行調(diào)控，缺乏生理過程和營(yíng)養(yǎng)需求的動(dòng)態(tài)、多尺度和全局性分析；3)未充分設(shè)計(jì)符合菌株生理特性的補(bǔ)料配方，并進(jìn)行精細(xì)而有效的補(bǔ)料控制；

指數(shù)補(bǔ)料是希望以指數(shù)生長(zhǎng)的方式收獲菌體的前饋控制式流加方式，流加速率與操作時(shí)間呈指數(shù)形式變化，但在指數(shù)補(bǔ)料后期溶氧難以維持，易出現(xiàn)碳溢流生成乙醇。DO-STAT法以溶氧的急劇上升作為碳源流加的信號(hào)，可以將基質(zhì)(碳源)濃度控制在接近于0的低水平，從而有效地抑制眾多代謝副產(chǎn)物的生成，但較長(zhǎng)的培養(yǎng)周期影響生產(chǎn)強(qiáng)度。由于蝦青素是胞內(nèi)產(chǎn)物，其產(chǎn)量與生物量和干菌體蝦青素含量有關(guān)，因此在最佳的培養(yǎng)基成分及含量中保證適宜的溫度、pH值、溶氧、電導(dǎo)率等環(huán)境條件，通過綜合指數(shù)補(bǔ)料與DO-STAT補(bǔ)料的特點(diǎn)建立合理的流加培養(yǎng)工藝，降低Crabtree效應(yīng)以限制或減少有害代謝產(chǎn)物(乙醇)的生成，可以達(dá)到高密度培養(yǎng)的目的，進(jìn)而大幅提高蝦青素的生產(chǎn)強(qiáng)度。

發(fā)明內(nèi)容