[發明專利]一種添加分子標簽的多重PCR方法及建庫儀器

在審

• 申請號: 202010314691.8
• 申請日: 2020-04-21
• 公開（公告）號: CN111379033A
• 公開（公告）日: 2020-07-07
• 發明（設計）人: 徐飛岳;王堰匯;緱靈山
• 申請（專利權）人: 深圳易倍科華生物科技有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12N15/10
• 代理公司: 深圳市創富知識產權代理有限公司 44367
• 代理人: 鐘文翰

本發明提供一種添加分子標簽的多重PCR方法，所述方法包括：選擇基因組位點或DNA區域作為DNA模板并進行引物組設計；對所述引物組添加對應的分子標簽；使用所述引物組以及通用引物對所述DNA模板進行第一輪多重PCR擴增，得到第一產物；對所述第一產物進行第一純化處理和切割不匹配分子標簽處理，以得到第二產物；使用通用引物對所述第二產物進行第二輪多重PCR擴增并添加索引，以得到第三產物；對所述第三產物進行第二純化處理，以得到文庫。此外，本發明還提供一種應用上述方法的建庫儀器。本發明提供的添加分子標簽的多重PCR方法，確保一個DNA模板唯一對應一個分子標簽，從而實現降低分子標簽冗余，提高檢測準確度，操作更簡單，建庫時間更短。

【技術領域】

本發明涉及基因測序文庫技術領域,具體涉及一種添加分子標簽的多重PCR方法及建庫儀器。

【背景技術】

目前NGS建庫富集的方法主要有兩種，一種是通過連接的方法加上接頭，再通過探針富集的方法，常稱之為探針捕獲法。一種是通過PCR 引物組經過多輪擴增建庫富集，該方法稱為多重PCR法。多重PCR法較探針法更快捷，靈活性更高而且成本更低，適用于起始量低，片段長度較大的樣本。測序和建庫過程中常常需要PCR的過程，尤其是多重 PCR法，都會出現一些系統錯誤，如illumina Hiseq平臺的測序錯誤率在 0.1-0.3％。但隨著對測序結果的準確度要求越來越高，需要添加分子標簽 (Unique molecular identifier,UMI)。

多重PCR法添加分子標簽具有較高難度，如果借鑒探針法添加分子標簽的方法，單純地在引物上添加分子標簽，隨著擴增循環數地增加，引入的分子標簽種類增多，面臨著一個基因組模板對應多個分子標簽的狀況。這樣就不是嚴格的一個模板對應一種分子標簽，導致后期分析操作誤認為有多個模板，結果可靠性降低。現有技術的一種方法是第一輪PCR時，設計單向引物，對模板進行擴增。單向引物帶有分子標簽和通用引物，產物則具有了分子標簽。再經過1-2輪PCR完成建庫和富集。該項技術的缺陷是在第一輪PCR中，如果是需要嚴格的分子標簽，則擴增循環數只能控制在1個循環，而單向擴增是線性擴增，效率較低且產物較少。第一輪PCR完成后需要進行純化去除引物組，進一步減少了帶有分子標簽的產物。如果在第一輪PCR進行多次擴增，得到的產物則帶有多種分子標簽，同樣影響結果可靠性。

【發明內容】

本發明的目的在于通過采用添加分子標簽的多重PCR方法，確保一個DNA模板唯一對應一個分子標簽，從而實現降低分子標簽冗余，提高檢測準確度。

為實現上述目的，本發明提供一種添加分子標簽的多重PCR方法，所述方法包括：

步驟S10：選擇基因組位點或DNA區域作為DNA模板并進行引物組設計；

步驟S20：對所述引物組添加對應的分子標簽；

步驟S30：使用所述引物組以及通用引物對所述DNA模板進行第一輪多重PCR擴增，得到第一產物；

步驟S40：對所述第一產物進行第一純化處理和切割不匹配分子標簽處理，以得到第二產物；

步驟S50：使用通用引物對所述第二產物進行第二輪多重PCR擴增并添加索引，以得到第三產物；

步驟S60：對所述第三產物進行第二純化處理，以得到文庫。

進一步地，所述引物組設計的引物形式包括常規單鏈引物、發夾引物和歐米伽引物中的任意一種或多種。

進一步地，所述第一輪多重PCR擴增反應包括3個循環。

進一步地，所述步驟S40包括：

步驟S410：對所述第一產物加入純化磁珠，洗滌純化后加入適量去離子水溶解；

步驟S420：加入錯配修復系統修復酶反應切割不匹配的分子標簽，以得到第二產物。