[發明專利]Reg3β/ HMGB1環路調控EAM小鼠巨噬細胞再編程的實驗方法

有效

• 申請號: 202010314514.X
• 申請日: 2020-04-21
• 公開（公告）號: CN111381050B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發明（設計）人: 邵曉軼;王守衛;金曉玲
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/573
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 徐思波

1.一種Reg3β/HMGB1環路調控EAM小鼠巨噬細胞再編程的實驗方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)體外研究Reg3β對EAM小鼠心肌浸潤巨噬細胞再編程及分泌HMGB1的影響及機制；

步驟(1)包括如下步驟：

(1-1)構建EAM小鼠模型，分離脾臟Ly6C^hi單核細胞和Ly6C^hiF4/80⁺細胞，體外以Reg3β處理；

(1-2)檢測細胞表面F4/80、CD206、CD80/86、MHCII、CD11c、SR-A/B、Dectin?1/2的表達，觀察ROS、IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-10、TGF-β、AREG、IGF-1、iNOS、Arg1的分泌；

(1-3)研究HMGB1的表達并鑒定其糖基化修飾，從而分析Reg3β對心肌浸潤表型、功能再編程及HMGB1分泌的影響；

(1-4)檢測PU.1、STAT1/3/6、IRF4/5、ATF3、PPARγ轉錄因子磷酸化水平，并觀察使用相應的轉錄因子抑制劑或siRNA后對上述表型和功能的影響，研究Reg3β調控心肌浸潤巨噬細胞再編程的機制；

(2)體外研究HMGB1對心肌細胞去分化、增殖及Reg3β釋放的影響及機制；

步驟(2)包括如下步驟：

(2-1)從無血清培養的上清中經親和層析分離和鑒定HMGB1，處理出生3-5天小鼠的心肌細胞；

(2-2)檢測心肌細胞特異性去分化標志RUNX1、cKIT、DAB2以及細胞內和培養上清中Reg3β的表達，觀察細胞增殖能力的變化；

(2-3)分析HMGB1對小鼠心肌細胞去分化、增殖及Reg3β表達的影響；

(2-4)檢測信號通路分子ERK1/2、Akt分子的磷酸化情況以及GSK3β/β-catenin的表達，并觀察使用相應信號分子拮抗劑或siRNA后對心肌細胞上述去分化標志表達和增殖能力的影響，研究HMGB1調控心肌細胞去分化/增殖的機制；

(3)體內驗證Reg3β/N₂-HMGB1環路調控巨噬細胞再編程參與EAM小鼠受損心肌修復的作用和機制；

步驟(3)包括如下步驟：

(3-1)分別構建αMHC-Cre、Reg3βLacZ/flox、CD11b-Cre、HMGB1LacZ/flox?BALB/c小鼠，前兩者雜交獲得Reg3β^-/-BALB/c小鼠，后兩者雜交獲得HMGB1^-/-BALB/c小鼠；

(3-2)分別在WT、Reg3β^-/-、單核/及HMGB1^-/-BALB/c小鼠基礎上誘導EAM模型，21天后采用心臟超聲和MRI檢測左心室功能；

(3-3)取各組小鼠心臟組織行HE染色和Sirius-red染色分別觀察心肌病理改變和纖維化程度，檢測心肌細胞RUNX1、cKIT、DAB2特異性去分化標志、Reg3β的表達以及ERK1/2、Akt、GSK3β/β-catenin信號通路的活化情況；

(3-4)觀察心肌組織浸潤，檢測表面F4/80、CD206、CD80/86、MHCII、CD11c、SR-A/B、Dectin?1/2的表達、分泌HMGB1、ROS、IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-10、TGF-β、AREG、IGF-1、iNOS、Arg1的功能、HMGB1的糖基化修飾情況以及PU.1、STAT1/3/6、IRF4/5、ATF3、PPARγ相關轉錄因子的磷酸化水平變化，從而在體內驗證Reg3β/N₂-HMGB1調控巨噬細胞再編程參與EAM小鼠受損心肌修復的作用和機制。