[發明專利]一種構建雙識別位點納米孔的方法

有效

• 申請號: 202010312465.6
• 申請日: 2020-04-20
• 公開（公告）號: CN111413383B
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發明（設計）人: 李偉;周智
• 申請（專利權）人: 深圳市梅麗納米孔科技有限公司
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/48
• 代理公司: 深圳市精英專利事務所 44242
• 代理人: 李翔宇

本發明公開了一種構建雙識別位點納米孔的方法，包括：對融合表達的兩種單識別位點納米孔進行結構域功能分析，獲得結構域分析結果；選擇結構域基因，進行融合蛋白設計，獲得具有兩個識別位點的融合蛋白；選擇保證融合蛋白結構穩定及可聚合的表達系統，根據表達系統的宿主種類，并依次完成表達方案設計、表達條件優化、孔道蛋白聚合、純化分離、嵌孔及測序以及融合蛋白突變的處理；本申請使用天然存在的單識別位點的納米孔蛋白，通過工程化的融合蛋白表達技術，獲得雙識別位點的納米孔道蛋白，大大擴展了納米孔蛋白的可選擇范圍，解決了天然存在的雙敏感位點的蛋白納米孔極少的問題。通過突變了優化孔道的性能，提高孔道的檢測性能。

技術領域

本發明涉及納米孔檢測技術領域，尤其涉及一種構建雙識別位點納米孔的方法。

背景技術

天然生物膜上存在一類跨膜蛋白通道，該蛋白通道具有納米尺度的直徑，允許離子及特定大小分子穿過，稱為納米孔。

將納米孔蛋白嵌在絕緣的人工薄膜上，置于導電離子液體中，并在薄膜兩側施加電壓，則帶電離子將穿越納米孔道形成離子電流。當有特定大小的分子穿過通道或結合到孔道上時，會阻塞孔道從而降低離子流，阻塞電流的大小與分子尺寸、電荷分布等特征信息相關,因此可通過測量阻塞電流的大小來識別分子。

運用這一原理，當核酸或者其他分析物在電壓的作用下瞬時穿過蛋白納米孔道時，通過測量堿基序列穿過孔道的阻塞電流變化就能實現核酸測序。現有的高通量測序技術需通過酶擴增和熒光標記的過程，因此具有速度慢、價格貴的缺點。相較于現有的測序方法，納米孔測序無需擴增，單分子即可測量，具有快速、低成本、長讀長、高靈敏度等特點。

已有部分蛋白納米孔道用于核酸等多聚物的檢測，例如用于核酸檢測的突變體α-溶血素納米孔(可參考下列文件：

CN107109479A，Kasianowicz et al.,Proc Natl Acad Sci USA,1996.93(24):13770，Stoddart et al.，Proc Natl Acad Sci USA，2009.106(19):7702)、MspA納米孔(CN107207571A，CN102216783A，CN106459159A，Derrington et al.,Proc Natl Acad SciUSA，2010.107(37)：16060，Manrao et al.,Nat Biotechnol，2012.30(4)：349)、CsgG納米孔(CN107207570A)，FraC納米孔(WO2018/012963A1，Wloka et al.，Angew Chem Int EdEngl，2016.55(40)：12494)，用于蛋白檢測的ClyA納米孔(CN105358567A，Biesemans，etal.，Nano Lett，2015.15(9):6076)。這些納米孔均為單識別位點或三個及以上識別位點的蛋白。

識別位點是指蛋白納米孔中一些特定的氨基酸位點，是納米孔檢測分子時電流信號的主要貢獻位點。識別位點的數量、形狀、電荷狀態、親疏水性等是決定納米孔檢測分辨率的關鍵因素。識別位點數量方面，以溶血素為對象的數學模擬研究表明，雙識別位點的納米孔比單識別位點具有更好的堿基識別效果(Stoddart，D.，et al.，Angew Chem Int EdEngl，2010.49(3)：p.556-9)。而三個及以上的識別位點則受限于信噪比，無法進行有效的堿基區分。

然而，天然存在的雙識別位點的蛋白納米孔極少，尋找合適的納米孔并進行相應的改造，是進一步提高測序準確度的關鍵。

公開于該背景技術部分的信息僅僅旨在加深對本發明的總體背景技術的理解，而不應當被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已為本領域技術人員所公知的現有技術。

基于上述原因，本申請人提出了一種構建雙識別位點納米孔的方法，旨在解決上述問題。

發明內容