[發明專利]一種構建雙識別位點納米孔的方法

有效

• 申請號: 202010312465.6
• 申請日: 2020-04-20
• 公開（公告）號: CN111413383B
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發明（設計）人: 李偉;周智
• 申請（專利權）人: 深圳市梅麗納米孔科技有限公司
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/48
• 代理公司: 深圳市精英專利事務所 44242
• 代理人: 李翔宇

1.一種構建雙識別位點納米孔的方法，其特征在于，包括以下步驟：

基于預先準備或融合表達蛋白的基因序列，使用結構域分析工具對融合表達的兩種單識別位點納米孔進行結構域功能分析，獲得結構域分析結果；

根據所述結構域分析結果，選擇結構域基因，進行融合蛋白設計，獲得具有兩個識別位點的融合蛋白，使所述具有兩個識別位點的融合蛋白包括磷脂膜結合結構域；

選擇保證融合蛋白結構穩定及可聚合的表達系統，根據表達系統的宿主種類，對融合蛋白基因序列進行密碼子優化，對融合蛋白基因序列的不同的表達質粒及表達菌株組合進行優化，獲得融合蛋白的成功表達，在融合蛋白末端設計純化標簽以實現蛋白表達后的純化；

通過優化表達條件，獲得折疊完整的融合蛋白；

通過優化純化方法，獲得高純度的融合蛋白單體或聚合體；

使用試劑對在融合蛋白表達后為單體表達的蛋白進行誘導，獲得組裝成聚合體形式的蛋白；

對融合表達后的蛋白單體和組裝成聚合體形式的蛋白進行純化分離；

使用包含已經進行純化分離處理的融合蛋白、膜層和電流測量裝置的測試系統，利用電流表征的手段進行分析物的檢測和表征；

通過突變對融合表達的雙識別位點納米孔蛋白的孔道內部的結構、電荷狀態及親疏水性進行優化，對突變后的蛋白進行表達后用于分析物檢測與表征。

2.根據權利要求1所述的構建雙識別位點納米孔的方法，其特征在于，所述獲得具有兩個識別位點的融合蛋白的步驟之后還包括：

選用蛋白三維結構模擬軟件進行模擬，獲得融合蛋白的三維結構，根據三維結構預測融合蛋白的折疊效果。

3.根據權利要求1所述的構建雙識別位點納米孔的方法，其特征在于，所述獲得具有兩個識別位點的融合蛋白的步驟之后還包括：

將來源于不同納米孔蛋白的結構域通過連接序列連接或進行直接連接。

4.根據權利要求1所述的構建雙識別位點納米孔的方法，其特征在于，所述使用試劑對在融合蛋白表達后為單體表達的蛋白進行誘導的步驟還包括，使用兔紅細胞膜或脂質體或兩親性的化學試劑進行誘導處理。

5.根據權利要求1所述的構建雙識別位點納米孔的方法，其特征在于，所述對融合表達后的蛋白單體和組裝成聚合體形式的蛋白進行純化分離的步驟包括，使用排阻色譜層析或密度梯度離心或超濾膜分離或切膠純化的處理對融合表達后的蛋白單體和組裝成聚合體形式的蛋白進行純化分離。

6.根據權利要求1所述的構建雙識別位點納米孔的方法，其特征在于，所述利用電流表征的手段進行分析物的檢測和表征的步驟包括，將所述融合蛋白置于第一導電液體介質與第二導電液體介質之間的膜層中，使所述第一導電液體介質與第二導電液體介質至少一項中含有分析物。

7.根據權利要求1所述的構建雙識別位點納米孔的方法，其特征在于，所述膜層為高分子膜、脂質層或固態膜；

所述分析物為核苷酸、核酸、氨基酸、寡聚肽、多肽、蛋白質、多聚物、藥物、無機分子、離子、污染物中的一種或多種。

8.根據權利要求1所述的構建雙識別位點納米孔的方法，其特征在于，所述分析物為納米級物質。

9.根據權利要求1所述的構建雙識別位點納米孔的方法，所述利用電流表征的手段進行分析物的檢測和表征的步驟包括：

a.組建包含融合表達蛋白及膜層的測試系統；

b.施加電壓，使分析物與融合納米孔相互作用或穿過納米孔；

c.分析物與融合納米孔相互作用或穿過納米孔時，獲取至少一個電流值，所述電流值指示所述分析物的至少一個特征，表征所述分析物。

10.根據權利要求9所述的構建雙識別位點納米孔的方法，其特征在于，所述組建包含融合表達蛋白及膜層的測試系統的步驟包括，將純化后的蛋白加入導電液體介質，根據蛋白自發嵌入或被誘導嵌入膜層中的原理，獲得兩種導電液體介質之間的唯一離子通道。

11.根據權利要求9所述的構建雙識別位點納米孔的方法，其特征在于，所述組建包含融合表達蛋白及膜層的測試系統的步驟包括，將所述蛋白與磷脂制備成囊泡，在囊泡形成的過程中，蛋白嵌入囊泡膜，將囊泡加入導電液體介質中，與膜層融合，蛋白同時嵌入膜層，獲得兩種導電液體介質之間的離子通道。