[發明專利]一種超靈敏檢測單增李斯特菌的膠體金免疫層析試劑盒

在審

• 申請號: 202010310111.8
• 申請日: 2020-04-17
• 公開（公告）號: CN111505280A
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發明（設計）人: 黃小林;熊勇華;周耀鋒;冷遠逵;陳靜;付金梅
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/558;G01N33/532;G01N33/52;G01N21/31
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 許瑩瑩

1.一種超靈敏檢測單增李斯特菌的膠體金免疫層析試劑盒，其特征在于，所述試劑盒由膠體金免疫層析試紙條和比色信號放大試劑組成，所述試紙條采用雙抗體夾心法檢測單增李斯特菌；所述比色信號放大試劑由金生長A液和金生長B液組成，金生長A液為聚合物和三價金離子(Au³⁺)混合的配位生長液，金生長B液為對苯二酚和檸檬酸三鈉混合的溶液。

2.根據權利要求1所述的一種超靈敏檢測單增李斯特菌的膠體金免疫層析試劑盒，其特征在于，所述膠體金免疫層析試紙條膠體金免疫層析試紙條由樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水紙依次固定于PVC塑料底板上，所述結合墊為噴涂有膠體金標記的單增李斯特菌檢測抗體的玻璃纖維膜，所述硝酸纖維素膜上設有檢測線和質控線，檢測線上包被有單增李斯特菌捕獲抗體，質控線上包被有驢抗鼠二抗溶液，相鄰間重疊部分長度為2mm，切割成4mm寬的試紙條。

3.根據權利要求1所述的一種超靈敏檢測單增李斯特菌的膠體金免疫層析試劑盒得制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)膠體金標記的單增李斯特菌檢測抗體的制備：取1mL粒徑為30～40nm檸檬酸包被膠體金溶液，用濃度0.2M的碳酸鉀溶液調節該溶液的pH值至7.0～8.0；向溶液加入5μL濃度為1～2mg/mL單增李斯特菌檢測抗體溶液，室溫下振蕩反應30min；然后再將100μL 1～2mg/mL牛血清白蛋白溶液加至上述混合溶液中繼續于室溫下振蕩反應30min；在4℃條件下，于10000rpm離心20min，棄上清，沉淀物復溶于0.01M pH7.4磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，得終產物膠體金標記的單增李斯特菌檢測抗體；

2)膠體金免疫層析試紙條的制備：a)結合墊的制備是將膠體金標記的單增李斯特菌檢測抗體噴涂于玻璃纖維膜上；b)具有檢測線和質控線的硝酸纖維膜的制備是將濃度為1～2mg/mL單增李斯特菌捕獲抗體和濃度為1～2mg/mL驢抗鼠二抗溶液分別噴涂硝酸纖維膜上繪制兩條線平行線，單增李斯特菌捕獲抗體溶液劃線作為檢測線(T線)，驢抗鼠二抗溶液劃線為質控線(C線)；c)膠體金免疫層析試紙條組裝：將樣品墊、具有金標檢測抗體的結合墊、具有T和C線的硝酸纖維膜和吸水紙分別依次粘貼到塑料襯板上，相鄰重疊部分的長度為2mm，切割成4mm寬的試紙條，密封干燥，于溫度保存；

3)比色信號放大試劑的配置：a)金生長A液：準確稱取200～400mg氯化金和100～200mg聚合物分別溶解于10mL超純水中，然后將二者混均制備金生長A液；b)金生長B液：準確稱取1～2g對苯二酚和1mg檸檬酸三鈉分別溶解于10mL和1mL超純水中，然后將二者混均制備金生長B液。

4.根據權利要求3所述的一種超靈敏檢測單增李斯特菌的膠體金免疫層析試劑盒的制備方法，其特征在于，所述聚合物為分子量2000～25000的聚乙烯亞胺PEI、分子量1000～20000的聚丙烯酸PAA、分子量2000～20000的聚乙烯吡咯烷酮PVP或分子量2000～30000的聚賴氨酸PL。

5.根據權利要求1所述的一種超靈敏檢測單增李斯特菌的膠體金免疫層析試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)用移液器準確取100～120μL待測樣品溶液加入到試紙條的檢測卡加樣孔中，于室溫反應5～10min；

2)將上述反應后的試紙條依次使用磷酸鹽緩沖液和超純水洗滌后，浸泡于金生長A液中室溫反應5min；

3)接著將試紙條轉移至金生長B液中繼續反應2min，肉眼觀察實驗結果，進行快速定性分析。