[發明專利]一種Caco-2細胞單層膜形成培養方法

有效

• 申請號: 202010300968.1
• 申請日: 2020-04-16
• 公開（公告）號: CN111500543B
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發明（設計）人: 冷毅斌;吳娟;李弘澤;嚴睿韜;寇小娟
• 申請（專利權）人: 武漢普諾賽生命科技有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 武漢藍寶石專利代理事務所(特殊普通合伙) 42242
• 代理人: 趙紅萬

本發明提出了一種Caco?2細胞單層膜形成培養方法：用含20％胎牛血清、1％青霉素/鏈霉素的MEM培養基培養Caco?2細胞，當細胞匯合度達到60％?70％時胰酶消化，連續傳代培養2?3次，待細胞培養到對數生長期，過量接種細胞培養，細胞貼壁展開后，用PBS清洗未貼壁細胞，即得到Caco?2單層膜細胞。本發明方法建立的Caco?2單層膜模型狀態良好，呈鋪路石狀鑲嵌狀排列，細胞之間緊密連接，基本無空泡形成，Caco?2細胞模型可靠穩定、重復性好，為后續的藥物吸收、轉運研究奠定實驗基礎。

技術領域

本發明涉及細胞培養領域，尤其涉及一種Caco-2細胞單層膜形成培養方法。

背景技術

細胞是生物體基本的結構和功能單位，也是細胞學實驗的研究對象，幾乎所有已知的疾病都與細胞息息相關，而細胞學實驗是生命科學領域研究細胞的最直接方式之一。狀態良好的細胞是細胞實驗最根本最重要的實驗材料之一，而細胞培養技術則是保證細胞狀態良好的決定性技術，已知不同來源的細胞種類已達千余種，且仍在增加，每種細胞甚至同種細胞的不同批次或代數都存在其各自最合適的培養方案。即使對于同一株細胞，針對不同的實驗目的，研究者們也摸索出了側重點各異的培養方法。

人結直腸腺癌細胞(the?human?colon?adenocarcinoma?cell?lines，Caco-2細胞)來源于人類結腸和直腸癌細胞；當長滿時，Caco-2細胞表現出特征性的腸上皮細胞分化。Caco-2細胞表達維甲酸結合蛋白I和維甲酸結合蛋白Ⅱ，并呈角質蛋白陽性。

Caco-2細胞單層膜模型是當前研究藥物對細胞作用的常用工具。目前的建模方式是根據實驗目的將細胞接種到對應的培養容器中，每隔1～2天在顯微鏡下觀察一次細胞狀態，并通常在第一周每隔兩天進行保守性的更換培養基操作，第二周及以后改為每天更換新鮮培養基。從接種到建模成功大約持續7～21天。從第7天開始，便可觀測細胞成膜進展，顯微鏡下能否觀察到細胞呈鋪路石狀鑲嵌狀排列是判斷建模是否成功的依據之一，此外，還需輔以多次測量跨膜電阻的大小，甘露醇或熒光黃透過性試驗及堿性磷酸酶活性等來最終確定建模是否成功。

然而，上述建模方式存在嚴重的缺陷或不足，主要體現在對細胞狀態的要求極為苛刻，需要細胞在全過程都處于比較良好的狀態，傳統成膜方法培養時間長，檢測次數多，極易造成細胞狀態變差或引起污染。具體地，存在以下幾個方面的難點：

1)如何保證接種時良好的細胞狀態，這取決于細胞的低傳代數和保藏、復蘇、運輸等技術。然而，目前細胞保藏、復蘇、運輸技術已成熟，能夠維持細胞的現有狀態；而高傳代次數意味著細胞狀態的下降和分化增多，會使細胞結構形態和功能發生改變，從而顯著降低建模成功率，即使建模成功，分化的細胞也已不再適合其他實驗的進行，并且隨著時間的推移，狀態良好的細胞的獲取成本也將逐漸升高。

2)如何維持接種后的細胞狀態，Caco-2在生長過程中會成團簇生長，實驗研究發現，按照已有文獻的接種方式接種細胞，會在成膜之前出現大量空泡，即便有些價格高昂的血清能在一定程度上減少空泡，但效果有限。

3)成膜時間長，期間需要進行多次檢測，易導致細胞狀態變差及細胞污染。

4)如上所述，對高成本的培養條件依賴性較大。

發明內容

有鑒于此，本發明提出了一種Caco-2細胞單層膜形成培養方法，以解決Caco-2細胞單層膜形成實驗周期長，狀態難以保證，實驗過程中出現空泡而導致實驗失敗的問題。

本發明的技術方案是這樣實現的：本發明提供了一種Caco-2細胞單層膜形成培養方法，包括如下步驟：

S1、用完全培養基培養細胞至匯合度達到60％-70％，去除培養基并加入胰酶消化3-5min，再加入完全培養基，輕柔地充分吹打細胞，獲得單細胞懸液，按體積比例均分至兩份進行下一次傳代培養；

S2、按照步驟S1方法進行多次傳代培養；