[發明專利]一種豬神經介素B多肽及其多克隆抗體制備方法和應用

有效

• 申請號: 202010300493.6
• 申請日: 2020-04-16
• 公開（公告）號: CN111499721B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 馬志禹;許艷;劉德鵬;楊瑞琪;郭軍培
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C07K14/575
• 分類號: C07K14/575;C07K19/00;C07K16/26;C07K16/06;G01N33/74
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 劉妍妍

1.一種豬神經介素B多肽，其特征在于，序列如序列表SEQ-3所示。

2.一種豬神經介素B多肽多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

將權利要求1所述的豬神經介素B多肽的C端修飾多肽與載體蛋白鑰孔戚血藍蛋白 KLH耦聯，獲得NMB修飾多肽-KLH耦聯蛋白；

乳化NMB修飾多肽-KLH耦聯蛋白并免疫新西蘭大白兔；

收集、分離得到含有兔抗豬NMB修飾多肽抗體的血清；

采用Protein G純化柱法對制備的NMB多克隆抗體進行純化。

3.根據權利要求2所述的豬神經介素B多肽多克隆抗體的制備方法，其特征在于，通過耦聯劑Sulfo-SMCC將豬神經介素B多肽的C端修飾多肽與載體蛋白鑰孔戚血藍蛋白 KLH耦聯。

4.根據權利要求2所述的豬神經介素B多肽多克隆抗體的制備方法，其特征在于，免疫的方法為：采用背部皮下多點注射的方法，將乳化后的抗原注射免疫新西蘭大白兔；首次免疫，取1mg完全抗原溶于1mL的PBS液中，并和等體積的弗氏完全佐劑進行充分乳化；首次免疫2周后進行加強免疫；加強免疫的次數為3次；四免后采集抗血清，對兔子進行麻醉，采用腹主動脈放血法大量采血，收集血液于37 ℃傾斜靜置1小時左右，然后轉入到4 ℃冰箱中靜置12小時左右，使其充分析出抗血清，離心分離抗血清，分裝保存于-80 ℃環境中。

5.根據權利要求2所述的豬神經介素B多肽多克隆抗體的制備方法，其特征在于，檢測抗血清的效價的方法為：用包被液把NMB多肽抗原稀釋成1-10 ug/mL，將稀釋好的抗原液于每個酶標板孔中加入100 uL，把酶標板置于濕盒內，于4 ℃包被過夜，用時在37 ℃溫箱中先孵育半個小時；棄去包被液，用洗滌液加入包被過的酶標板孔中，用紗布或者濾紙扣干，洗3次，每次3-5 min；在酶標板上每孔加入250 uL封閉液，將酶標板置于濕盒內，37 ℃孵育2 h，洗板同上；空白對照加入抗體稀釋液，陰性對照加入未免血清，實驗組加入倍比稀釋1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400、1:204800、1:409600、1:819200、1:1638400、1:3276800的抗血清，然后，將酶標板置于濕盒內，37 ℃孵育1-2 h，洗板同上；酶標板各孔加入稀釋倍數為1:3000的辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗100 uL，將酶標板置于濕盒內，37 ℃孵育1-2 h，洗板同上；酶標板的每個孔中直接加入100 uL TMB-過氧化氫尿素底物溶液，室溫或37 ℃溫育5-30 min；向每孔中加入100 uL 2 M硫酸終止液終止反應；將酶標板置于酶標儀中，測定450 nm波長處的吸光度；當與陰性對照血清的比值大于2.1時，計算抗體效價。

6.根據權利要求2所述的豬神經介素B多肽多克隆抗體的制備方法，其特征在于，抗體純化的方法為：用注射器吸取10 mL的binding buffer，一滴一滴地注入柱子，防止空氣進入柱子中，速度1 mL/min；吸取0.5 mL抗血清+1.5 mL binding buffer，加入柱中；用10 mL的binding buffer洗柱子；在收集蛋白的EP管中先加入200 μL的1 M Tris-HCl；用3 mL的elution buffer洗脫柱子；收集純化的NMB抗體。

7.根據權利要求2所述的豬神經介素B多肽多克隆抗體的制備方法，其特征在于，對純化后的NMB多克隆抗體進行豬組織中NMB蛋白的免疫印跡檢測。

8.一種豬神經介素B多肽多克隆抗體，其特征在于，采用權利要求2~7任一項所述方法制備而成。

9.權利要求8所述豬神經介素B多肽多克隆抗體在檢測豬組織NMB蛋白水平方面的應用。