[發明專利]干細胞高效表達外泌體用于皮膚美容的制備方法和產品

有效

• 申請號: 202010296426.1
• 申請日: 2020-04-15
• 公開（公告）號: CN111437244B
• 公開（公告）日: 2022-08-23
• 發明（設計）人: 劉榮坤;劉芳;岳緒娥
• 申請（專利權）人: 北京本真工坊生物科技有限公司
• 主分類號: A61K8/99
• 分類號: A61K8/99;A61K8/02;A61K8/20;A61K8/34;A61K8/365;A61K8/49;A61K8/60;A61K8/73;A61K8/9728;A61Q19/00;C12N15/85;C12N15/12;C12N5/10
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 陳圣清

本發明公開了一種干細胞高效表達外泌體用于皮膚美容的制備方法和產品，其中制備方法包括：從人體組織中分離干細胞并進行培養；構建重組表達載體并將重組表達載體加入干細胞的培養懸液，采用電轉染方式獲得能夠表達目的蛋白的干細胞，由干細胞上清液中提取出外泌體，按重量份添加輔料并利用液氮進行瞬間凍干，對獲得片劑在真空環境下干燥。通過本發明的技術方案，可以將重組表達載體轉移至干細胞中，提取得到目的蛋白外泌體，并利用凍干技術制備用于皮膚美容的產品，有效保護了外泌體的活性成分，能夠在室溫條件下長期儲存且保持活性。

技術領域

本發明涉及干細胞外泌體技術領域，尤其涉及一種干細胞高效表達外泌體用于皮膚美容的制備方法和一種干細胞高效表達外泌體用于皮膚美容的產品。

背景技術

干細胞外泌體在國外研究已經多年，用于市場上的外泌體越來越多，而國內對于干細胞外泌體的應用也隨之越來越多，用于美容護膚的產品種類也越來越多，但是干細胞外泌體的表達效率較低、蛋白表達量較低，應用于美容護膚的效果一般，且干細胞外泌體長期儲存會導致定向分泌的不足、活性降低等缺點。

發明內容

針對上述問題中的至少之一，本發明提供了一種干細胞高效表達外泌體用于皮膚美容的制備方法和產品，通過電轉染方式將重組表達載體轉移至干細胞中，從而提取得到目的蛋白外泌體，在此基礎上利用凍干技術制備用于皮膚美容的產品，有效保護了干細胞高效表達外泌體的活性成分，所制備的外泌體凍干緩釋片劑能夠在室溫條件下長期儲存，彌補了干細胞外泌體定向分泌的不足、長時間儲存活性降低等缺點。此外，采用人源啟動子EF1A，在寡肽-1和堿性成纖維蛋白或其他蛋白N端融合CD33信號肽，有利于蛋白分泌，采用IRES表達原件可以增加兩種細胞因子的協同作用，使兩種細胞因子同時表達，采用附加體系統可以使轉移的重組表達載體質粒在干細胞內長時間存在并高效表達目的蛋白，采用PURO序列篩選標記可以迅速獲得高表達的細胞，從而定向高效表達所需目的蛋白。

為實現上述目的，本發明提供了一種干細胞高效表達外泌體用于皮膚美容的制備方法，包括：從人體組織中分離干細胞并進行培養；結合PB轉座子、EF1A啟動子序列、KOZAK序列、所要表達的目的蛋白序列1、T2A序列、所要表達的目的蛋白序列2、CD33信號肽序列、IRES序列、PURO序列和附加體系統，構建重組表達載體；將所述重組表達載體加入所述干細胞的培養懸液，采用電轉染方式獲得能夠表達所述目的蛋白的干細胞；由電轉染后的干細胞上清液中無菌提取出外泌體，按重量份計，添加50份的所述外泌體、1-5份的甘油、1-5份的透明質酸、0.01-0.02份的丁二醇、0.1-5份的北美金縷梅提取物、0.1-2份的尿囊素、0.1-2份的銀耳提取物、0.1-5份的甘露糖醇、1-5份的β-葡萄糖、0.9份的氯化鈉、1-10份的普魯蘭、1-10份的海藻糖、0.5-5重量份的甘露醇、1-10份的右旋糖酐、1-5份的葡萄糖、0.5-10份的乳酸鈉、0.5-2份的氯化鉀、5-10份的白蛋白以及適量的去離子水，進行混合攪拌；采用液氮對混合后的物料進行三秒瞬間凍干休眠，并在真空環境下干燥以將凍干獲得片劑中的冰結晶升華排出。

在上述技術方案中，優選地，所述重組表達載體中包括兩種目的蛋白的序列，所要表達的目的蛋白序列1和所要的表達目的蛋白序列2分別設置于所述T2A序列的前后兩側。

在上述技術方案中，優選地，所述目的蛋白包括寡肽-1、堿性成纖維蛋白、角質蛋白、膠原蛋白、纖維連接蛋白、原纖蛋白、再生蛋白、轉化因子和胰島素樣生長因子。

在上述技術方案中，優選地，所述人體組織中分離出的所述干細胞包括間充質干細胞、脂肪干細胞和上皮干細胞，所述人體組織包括人臍帶組織和脂肪組織。