[發(fā)明專利]干細胞高效表達外泌體用于皮膚美容的制備方法和產(chǎn)品

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010296426.1
• 申請日: 2020-04-15
• 公開（公告）號: CN111437244B
• 公開（公告）日: 2022-08-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉榮坤;劉芳;岳緒娥
• 申請（專利權(quán)）人: 北京本真工坊生物科技有限公司
• 主分類號: A61K8/99
• 分類號: A61K8/99;A61K8/02;A61K8/20;A61K8/34;A61K8/365;A61K8/49;A61K8/60;A61K8/73;A61K8/9728;A61Q19/00;C12N15/85;C12N15/12;C12N5/10
• 代理公司: 北京匯信合知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11335
• 代理人: 陳圣清

1.一種干細胞高效表達外泌體用于皮膚美容的制備方法，其特征在于，包括：

從人體組織中分離干細胞并進行培養(yǎng)；

結(jié)合PB轉(zhuǎn)座子、EF1A啟動子序列、KOZAK序列、所要表達的目的蛋白序列1、T2A序列、所要表達的目的蛋白序列2、CD33信號肽序列、IRES序列、PURO序列和附加體系統(tǒng)，構(gòu)建重組表達載體；其中，所要表達的目的蛋白序列1和所要表達的目的蛋白序列2分別設(shè)置于所述T2A序列的前后兩側(cè)，所述目的蛋白包括寡肽-1、堿性成纖維蛋白、角質(zhì)蛋白、膠原蛋白、纖維連接蛋白、原纖蛋白、再生蛋白、轉(zhuǎn)化因子和胰島素樣生長因子；

將所述重組表達載體加入所述干細胞的培養(yǎng)懸液，采用電轉(zhuǎn)染方式獲得能夠表達所述目的蛋白的干細胞；

由電轉(zhuǎn)染后的干細胞上清液中無菌提取出外泌體，按重量份計，添加50份的所述外泌體、1-5份的甘油、1-5份的透明質(zhì)酸、0.01-0.02份的丁二醇、0.1-5份的北美金縷梅提取物、0.1-2份的尿囊素、0.1-2份的銀耳提取物、0.1-5份的甘露糖醇、1-5份的β-葡萄糖、0.9份的氯化鈉、1-10份的普魯蘭、1-10份的海藻糖、0.5-5份的甘露醇、1-10份的右旋糖酐、1-5份的葡萄糖、0.5-10份的乳酸鈉、0.5-2份的氯化鉀、5-10份的白蛋白以及適量的去離子水，進行混合攪拌；

采用液氮對混合后的物料進行三秒瞬間凍干休眠，并在真空環(huán)境下干燥以將凍干獲得片劑中的冰結(jié)晶升華排出。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細胞高效表達外泌體用于皮膚美容的制備方法，其特征在于，所述人體組織中分離出的所述干細胞包括間充質(zhì)干細胞、脂肪干細胞和上皮干細胞，所述人體組織包括人臍帶組織和脂肪組織。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細胞高效表達外泌體用于皮膚美容的制備方法，其特征在于，所述電轉(zhuǎn)染方式的實施步驟包括：

在電轉(zhuǎn)染實施前1-2天，將所述干細胞轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶，使得電轉(zhuǎn)染前所述干細胞的細胞匯合度為50％-70％；

采用PBS緩慢沖洗所述干細胞，再吸出所述PBS，采用胰酶蛋白酶消化所述干細胞，再加入含血清的培養(yǎng)基中和胰酶；

離心收集所述干細胞，采用PBS、hepes和無血清培養(yǎng)基重懸細胞，使之密度為1×10⁶～5×10⁶cell/ml；

設(shè)置電轉(zhuǎn)染參數(shù)為2.0kV、25uFD；

將線性化的所述重組表達載體的質(zhì)粒加入電轉(zhuǎn)杯，根據(jù)所述干細胞種類設(shè)置所述質(zhì)粒的起始濃度為10～50μg/ml；

向電擊杯中加入重懸后的細胞，顛轉(zhuǎn)所述電擊杯進行混勻；

將所述電擊杯放入電擊槽中，進行一次脈沖電擊；

將電擊后的細胞轉(zhuǎn)移至含有培養(yǎng)基的孔中；

晃動孔板以混勻細胞，電轉(zhuǎn)24～48小時后，細胞基因瞬時表達。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細胞高效表達外泌體用于皮膚美容的制備方法，其特征在于，所述目的蛋白為寡肽-1和堿性成纖維蛋白時，所述重組表達載體為PB—EF1A—KOZAK—寡肽-1—T2A—堿性成纖維蛋白—CD33—IRES—PURO,附加體ORI—附加體EBNA1；

所述目的蛋白為寡肽-1和角質(zhì)蛋白時，所述重組表達載體為PB—EF1A—KOZAK—寡肽-1—T2A—角質(zhì)蛋白—CD33—IRES—PURO,附加體ORI—附加體EBNA1。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的干細胞高效表達外泌體用于皮膚美容的制備方法，其特征在于，從人臍帶組織中分離間充質(zhì)干細胞的步驟包括：

分離得到人臍帶組織塊，并利用胰酶消化5-10分鐘；

收集組織懸液并離心，棄掉上清液，將所述組織塊貼放到平皿中；

加入DMEM細胞培養(yǎng)基，定期半量換液；

待細胞長滿平皿后，去除所述組織塊；

利用胰酶消化處理后將所述平皿上的原代細胞轉(zhuǎn)移至T75培養(yǎng)瓶中；

待細胞長滿培養(yǎng)瓶并傳代至2-3代，得到間充質(zhì)干細胞。