[發明專利]一種檢測雙鏈RNA的方法及其試劑盒與應用

有效

• 申請號: 202010289477.1
• 申請日: 2020-04-14
• 公開（公告）號: CN111363787B
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 王樂樂;劉剛;許麗;聞艷麗;楊鎮州;楊雪;李蘭英
• 申請（專利權）人: 上海市計量測試技術研究院
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發明提供一種檢測雙鏈RNA的方法及其試劑盒與應用。所述方法包括如下步驟：待測樣品中的雙鏈RNA、taqman探針與RNA間隔探針雜交得到雜交產物，利用雙鏈特異性核酸酶進行切割，所述taqman探針從所述雜交產物上脫落并發出熒光，而后繼續雜交并切割，分析熒光信號，得到所述雙鏈RNA的檢測結果。所述方法操作簡單，利用DSN酶的切割特性，切割雜交所得到的DNA/RNA雙鏈，被切割之后的taqman探針從雙鏈上脫落并發出熒光，所述RNA間隔探針能夠促進RNA二級結構的展開，提高taqman探針與dsRNA的雜交效率，實現定量檢測，檢測范圍廣，能夠檢測1pM～50nM范圍內的dsDNA。

技術領域

本發明屬于核酸檢測領域，涉及一種檢測雙鏈RNA的方法及其試劑盒與應用，尤其涉及一種檢測RNAi轉基因作物中的雙鏈RNA的方法及其試劑盒與應用。

背景技術

DSN(Duplex-specific?nuclease，雙鏈特異性核酸酶)是一種從堪察加螃蟹(Paralithodes?camtschaticus)肝胰腺中提取的一種熱穩定核酸酶，能夠選擇性降解雙鏈DNA和DNA-RNA雜交體中的DNA，對ssDNA或RNA幾乎沒有活性。由于DSN的獨特的性質，在設計合成的DNA探針形成DNA-RNA雜交時，DSN非常適合于RNA的檢測。近年來，熒光法、電化學法和比色法中廣泛使用DSN檢測RNA，且具有很高的靈敏度。

RNA干擾(RNAi)是指外源性的雙鏈RNA(double-stranded?RNA，dsRNA)分子引起的序列特異性降解靶基因信使RNA(mRNA)，導致內源靶基因沉默的現象。RNAi首先發現于秀麗隱桿線蟲中，隨后逐漸成為一種有力的工具被用于新型轉基因抗蟲作物的培育。與傳統轉基因技術相比，RNAi技術應用于抗蟲作物上時具有更高的特異性，效果更好。然而，RNAi技術潛在的風險包括非期望的基因沉默和對人與環境的危害也引起了人們的關注。

由于RNAi轉基因作物不表達新的蛋白，所以dsRNA成了RNAi轉基因作物檢測的最佳候選物。然而，相比于MicroRNA(miRNA)，RNAi產生的dsRNA具有復雜的二級結構，這對于準確、靈敏地檢測dsRNA是一個極大的挑戰。

生物樣品中dsRNA的檢測方法包括逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和Northernblots。盡管變性的Northern?blots可以檢測出dsRNA的種類，但是這個方法的通量很低，而且需要大量的RNA樣品。RT-PCR是一個高通量的檢測方法，能夠擴增具有復雜二級結構、反向重復序列的dsRNA。

但是，RT-PCR擴增dsRNA也存在一些缺點，比如RNA雙向表達時的自啟動會干擾模板的特異性，特異性地檢測dsRNA時需要修改標準的RT-PCR方法。此外，RNA樣品需要純化，以消除與基因組DNA中同源序列的雜交。同時，dsRNA復雜的二級結構常常會導致檢測結果準確度較低，且靈敏度較差。

因此，開發一種準確、靈敏度高且操作簡單的dsRNA檢測方法，是檢測RNAi轉基因植物中dsRNA時亟需解決的問題。

發明內容

鑒于現有技術中存在的問題，本發明提供了一種檢測雙鏈RNA的方法及其試劑盒與應用，即基于雜交的熒光平臺并輔以DSN酶的信號放大手段，實現雙鏈RNA的定量分析，且所述方法簡單、快速、特異且靈敏度較高。

為達此目的，本發明采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供一種檢測雙鏈RNA(dsRNA)的方法，所述方法包括如下步驟：taqman探針、RNA間隔探針(RNAspacer)與待測樣品中的雙鏈RNA雜交得到雜交產物，利用雙鏈特異性核酸(DSN)酶進行切割，所述taqman探針從所述雜交產物上脫落并發出熒光，而后繼續雜交并切割，分析熒光信號，得到所述雙鏈RNA的檢測結果。