[發明專利]一種檢測雙鏈RNA的方法及其試劑盒與應用

有效

• 申請號: 202010289477.1
• 申請日: 2020-04-14
• 公開（公告）號: CN111363787B
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 王樂樂;劉剛;許麗;聞艷麗;楊鎮州;楊雪;李蘭英
• 申請（專利權）人: 上海市計量測試技術研究院
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.一種檢測雙鏈RNA的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

待測樣品中的雙鏈RNA、taqman探針與RNA間隔探針雜交得到雜交產物，利用雙鏈特異性核酸酶進行切割，所述taqman探針從所述雜交產物上脫落并發出熒光，而后繼續雜交并切割，分析熒光信號，得到所述雙鏈RNA的檢測結果；

所述taqman探針的數量為至少兩條；

所述RNA間隔探針的數量為至少兩條；

所述taqman探針配對的核苷酸序列位于所述RNA間隔探針配對的核苷酸序列之間。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述taqman探針的制備方法為：

根據待測樣品中雙鏈RNA的核苷酸序列設計出配對的DNA序列，合成，并在所述DNA序列的5′端修飾熒光基團，3′端修飾熒光淬滅基團得到所述taqman探針。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA間隔探針的制備方法為：

根據待測樣品中雙鏈RNA的核苷酸序列設計出配對的RNA序列，合成得到所述RNA間隔探針。

4.根據權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)將待測樣品、taqman探針與RNA間隔探針混合，加熱后退火，所述待測樣品中的雙鏈RNA與所述taqman探針和RNA間隔探針發生雜交，得到雜交產物；

(2)在雙鏈特異性核酸酶的作用下對步驟(1)所述的雜交產物進行切割，所述雜交產物上的taqman探針被切割并脫落，發出熒光；

(3)taqman探針脫落后的雜交產物與體系中游離的完整的taqman探針雜交，而后再被所述雙鏈特異性核酸酶切割，繼續循環，分析被切割的taqman探針發出的熒光信號，得到所述雙鏈RNA的檢測結果。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述加熱的溫度為80-99℃，時間為5-15min；

步驟(2)所述雙鏈特異性核酸酶的工作溫度為55-65℃；

步驟(3)所述循環的時間為20-60min；

終止步驟(3)所述循環的方法為加入雙鏈特異性核酸酶終止反應液。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(3)分析操作還包括制備標準曲線；

所述標準曲線的制備方法為：

采用已知濃度的dsRNA、taqman探針與RNA間隔探針雜交得到雜交產物，利用雙鏈特異性核酸酶進行切割，所述taqman探針從所述雜交產物上脫落并發出熒光，而后繼續雜交并切割，分析熒光信號，并繪制濃度與熒光信號值的標準曲線。

7.根據權利要求5-6任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)將待測樣品、taqman探針與RNA間隔探針混合，80-99℃加熱5-15min，退火，所述待測樣品中的雙鏈RNA與所述taqman探針和RNA間隔探針發生雜交，得到雜交產物；

(2)雙鏈特異性核酸酶在55-65℃下，對步驟(1)所述的雜交產物進行切割，所述雜交產物上的taqman探針被切割并脫落，發出熒光；

(3)taqman探針脫落后的雜交產物與體系中游離的完整的taqman探針雜交，而后再被所述雙鏈特異性核酸酶切割，繼續循環，所述循環的時間為20-60min，加入雙鏈特異性核酸酶終止反應液，分析被切割的taqman探針發出的熒光信號，得到所述雙鏈RNA的檢測結果。

8.一種檢測雙鏈RNA的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒利用如權利要求1-7任一項所述的方法檢測雙鏈RNA，所述試劑盒中包括：taqman探針、RNA間隔探針、雙鏈特異性核酸酶和RNA酶抑制劑。

9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包含至少兩條taqman探針；

所述試劑盒中包含至少兩條RNA間隔探針；

所述試劑盒中還包含雙鏈特異性核酸酶緩沖液；

所述試劑盒中還包含雙鏈特異性核酸酶終止反應液。

10.如權利要求8或9所述的試劑盒在檢測RNAi轉基因作物的雙鏈RNA含量中的應用。