[發明專利]一種檢測溴敵隆的酶聯免疫試劑盒及其制備和應用

在審

• 申請號: 202010285672.7
• 申請日: 2020-04-13
• 公開（公告）號: CN111273018A
• 公開（公告）日: 2020-06-12
• 發明（設計）人: 溫凱;馬立才;劉河冰;聶靖東;邢維維;劉薇;楊柳;丁亞芳;崔乃元
• 申請（專利權）人: 北京維德維康生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N33/577;G01N33/543;G01N33/53
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種檢測溴敵隆的ELISA方法及其試劑盒，本發明所提供的檢測溴敵隆的酶聯免疫試劑盒由酶標板（包被式I溴敵隆藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物）、抗體工作液（含溴敵隆藥物單克隆抗體）、酶標記物工作液（含辣根過氧化物酶標記的抗溴敵隆藥物單克隆抗體的抗抗體）、洗滌液、樣品稀釋液、樣品提取液、含不同梯度濃度溴敵隆標準品溶液、底物顯色液、終止液組成。本發明所提供的溴敵隆檢測試劑盒可用于食品中毒物的檢測，還可用于人血清檢測，在豬肉、牛奶、血清中的溴敵隆的檢測限為5 μg/kg，批間變異系數小于10%、批內變異系數小于15%，具有操作簡單、快速，靈敏度高、特異性強、準確性強的優點，對于食物中毒的快速檢測具有重大價值。

技術領域

本發明屬于藥物殘留快速檢測領域，涉及一種檢測溴敵隆的試劑盒及其制備方法與應用。

背景技術

溴敵隆化學名是3-(4-羥基-3-香豆素)-3-苯基-1-(對溴聯苯基)-丙醇-1，屬4-羥基雙香豆素類抗凝血鼠藥。它通過競爭性地抑制維生素K的作用，抑制肝臟產生凝血酶原及凝血因子，提高毛細血管通透性和脆性，造成鼠內出血死亡。隨著滅鼠劑的大量施用，鼠藥不可避免地殘留在食物中，影響人類健康。近年來，此類滅鼠劑造成中毒的事件時有發生，嚴重危害人民身體健康與生命安全。

目前溴敵隆的檢測方法主要有高效液相法和液相色譜質聯用法，這些方法特異性強、靈敏度高，但是操作繁瑣、儀器昂貴，不適用于大批量樣品的篩選檢測。而快速檢測方法主要是化學法比色檢測方法，特異性、靈敏度差，易發生誤判，不能滿足現場檢測需求。

發明內容

本發明的目的在于提供一種溴敵隆酶聯免疫檢測試劑盒，并提供一種靈敏度高、特異性強、檢測成本低、適于大批量樣品篩選的檢測方法。

為了實現上述目的，本發明的技術方案如下：

一種檢測溴敵隆的酶聯免疫試劑盒，由溴敵隆檢測酶標板、溴敵隆系列標準品工作液、溴敵隆抗體工作液、酶標記物工作液、樣品稀釋液、樣品提取液、洗滌液、底物顯色液、終止液組成。

所述溴敵隆酶標板由溴敵隆藥物半抗原與載體蛋白的偶聯物包被制成，溴敵隆半抗原為式I所示化合物：

式I

所述溴敵隆半抗原是溴敵隆和鄰苯二甲酸酐反應得到的，具體制備方法如下：稱取500mg溴敵隆用6 mL吡啶溶解，加入鄰苯二甲酸酐154.45 mg，加熱至60℃攪拌，純化，旋干，終止反應，得到式I所述化合物。

所述載體蛋白為牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、鼠血清蛋白（MSA）、甲狀腺蛋白（BCG）、兔血清蛋白（RSA）、血藍蛋白（KLH）或卵清白蛋白（OVA）。

所述溴敵隆半抗原與載體蛋白的偶聯物是指溴敵隆半抗原與載體蛋白通過活性酯法得到的產物，具體包括如下步驟：

1）將所述溴敵隆半抗原（式I）溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），20-25℃磁力攪拌反應2-3h，得到溶液I；

其中，所述溴敵隆半抗原（式I）、所述二甲基甲酰胺（DMF）、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、所述N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）的配比為30.22 mg：1.5 mL：25.75 mg：15.46 mg；

2）將所述載體蛋白置于0.1 M碳酸氫鈉緩沖液中，200 rpm攪拌10 min，充分溶解，得到溶液II；所述載體蛋白與所述0.1 M碳酸氫鈉緩沖液的配比為50 mg：3.5 mL；