[發(fā)明專利]一種檢測溴敵隆的酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備和應用

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• 申請日: 2020-04-13
• 公開（公告）號: CN111273018A
• 公開（公告）日: 2020-06-12
• 發(fā)明（設計）人: 溫凱;馬立才;劉河冰;聶靖東;邢維維;劉薇;楊柳;丁亞芳;崔乃元
• 申請（專利權）人: 北京維德維康生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N33/577;G01N33/543;G01N33/53
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本發(fā)明公開了一種檢測溴敵隆的ELISA方法及其試劑盒，本發(fā)明所提供的檢測溴敵隆的酶聯(lián)免疫試劑盒由酶標板（包被式I溴敵隆藥物半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物）、抗體工作液（含溴敵隆藥物單克隆抗體）、酶標記物工作液（含辣根過氧化物酶標記的抗溴敵隆藥物單克隆抗體的抗抗體）、洗滌液、樣品稀釋液、樣品提取液、含不同梯度濃度溴敵隆標準品溶液、底物顯色液、終止液組成。本發(fā)明所提供的溴敵隆檢測試劑盒可用于食品中毒物的檢測，還可用于人血清檢測，在豬肉、牛奶、血清中的溴敵隆的檢測限為5 μg/kg，批間變異系數(shù)小于10%、批內(nèi)變異系數(shù)小于15%，具有操作簡單、快速，靈敏度高、特異性強、準確性強的優(yōu)點，對于食物中毒的快速檢測具有重大價值。

技術領域

本發(fā)明屬于藥物殘留快速檢測領域，涉及一種檢測溴敵隆的試劑盒及其制備方法與應用。

背景技術

溴敵隆化學名是3-(4-羥基-3-香豆素)-3-苯基-1-(對溴聯(lián)苯基)-丙醇-1，屬4-羥基雙香豆素類抗凝血鼠藥。它通過競爭性地抑制維生素K的作用，抑制肝臟產(chǎn)生凝血酶原及凝血因子，提高毛細血管通透性和脆性，造成鼠內(nèi)出血死亡。隨著滅鼠劑的大量施用，鼠藥不可避免地殘留在食物中，影響人類健康。近年來，此類滅鼠劑造成中毒的事件時有發(fā)生，嚴重危害人民身體健康與生命安全。

目前溴敵隆的檢測方法主要有高效液相法和液相色譜質(zhì)聯(lián)用法，這些方法特異性強、靈敏度高，但是操作繁瑣、儀器昂貴，不適用于大批量樣品的篩選檢測。而快速檢測方法主要是化學法比色檢測方法，特異性、靈敏度差，易發(fā)生誤判，不能滿足現(xiàn)場檢測需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種溴敵隆酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，并提供一種靈敏度高、特異性強、檢測成本低、適于大批量樣品篩選的檢測方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案如下：

一種檢測溴敵隆的酶聯(lián)免疫試劑盒，由溴敵隆檢測酶標板、溴敵隆系列標準品工作液、溴敵隆抗體工作液、酶標記物工作液、樣品稀釋液、樣品提取液、洗滌液、底物顯色液、終止液組成。

所述溴敵隆酶標板由溴敵隆藥物半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物包被制成，溴敵隆半抗原為式I所示化合物：

式I

所述溴敵隆半抗原是溴敵隆和鄰苯二甲酸酐反應得到的，具體制備方法如下：稱取500mg溴敵隆用6 mL吡啶溶解，加入鄰苯二甲酸酐154.45 mg，加熱至60℃攪拌，純化，旋干，終止反應，得到式I所述化合物。

所述載體蛋白為牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、鼠血清蛋白（MSA）、甲狀腺蛋白（BCG）、兔血清蛋白（RSA）、血藍蛋白（KLH）或卵清白蛋白（OVA）。

所述溴敵隆半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物是指溴敵隆半抗原與載體蛋白通過活性酯法得到的產(chǎn)物，具體包括如下步驟：

1）將所述溴敵隆半抗原（式I）溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），20-25℃磁力攪拌反應2-3h，得到溶液I；

其中，所述溴敵隆半抗原（式I）、所述二甲基甲酰胺（DMF）、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、所述N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）的配比為30.22 mg：1.5 mL：25.75 mg：15.46 mg；

2）將所述載體蛋白置于0.1 M碳酸氫鈉緩沖液中，200 rpm攪拌10 min，充分溶解，得到溶液II；所述載體蛋白與所述0.1 M碳酸氫鈉緩沖液的配比為50 mg：3.5 mL；