[發明專利]非洲豬瘟病毒P30蛋白單克隆抗體篩選和檢測用試劑盒及其制備方法

在審

• 申請號: 202010285019.0
• 申請日: 2020-04-15
• 公開（公告）號: CN111474367A
• 公開（公告）日: 2020-07-31
• 發明（設計）人: 孫統威;周晶晶;徐慧珍
• 申請（專利權）人: 杭州恒奧科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;G01N33/569;G01N33/543;G01N33/531
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本發明公開了一種非洲豬瘟病毒P30蛋白單克隆抗體鑒定用ELISA試劑盒和該試劑盒的制備方法以及使用方法。本發明所提供的試劑盒能夠在不使用非洲豬瘟病毒的前提下用于非洲豬瘟病毒P30蛋白單克隆抗體大規模篩選和檢測。

技術領域

本發明涉及一種非洲豬瘟病毒P30蛋白單克隆抗體鑒定用ELISA試劑盒及其檢測方法和制備方法。屬于生物醫藥領域，具體屬于病毒疫病診斷技術和動物檢疫領域。

背景技術

非洲豬瘟(英文名稱：African Swine fever，簡稱：ASF)是由非洲豬瘟病毒(英文名稱：African Swine fevervirus，簡稱：ASFV)感染家豬和各種野豬(如非洲野豬、歐洲野豬等)引起一種急性、出血性、烈性傳染病。世界動物衛生組織(OIE)將其列為法定報告動物疫病，該病也是我國重點防范的一類動物疫情。其特征是發病過程短，最急性和急性感染死亡率高達100％，臨床表現為發熱(達40～42℃)，心跳加快，呼吸困難，部分咳嗽，眼、鼻有漿液性或粘液性膿性分泌物，皮膚發紺，淋巴結、腎、胃腸粘膜明顯出血，非洲豬瘟臨床癥狀與豬瘟癥狀相似。

非洲豬瘟病毒是一種大的、有囊膜的雙鏈DNA病毒。其基因組為末端共價閉合的單分子線狀雙鏈DNA，病毒基因組全長為170kb-190kb，中央有125kb左右的保守區，兩端為可變區，含有末端反轉重復序列，這些重復序列的增加或者缺失是造成不同分離株基因組長度差異的主要原因(Rafacl，Yancz，JavierM，et al.Analysis of the completeNucleotide Sequence of Afican Swine FeverVirus[J].Virology，1995，208：249-279)。ASFV形態為正二十面體，直徑約200納米，由多層物質構成：中央為內含擬核的蛋白質核殼，由內向外分別還有一層脂質包膜和蛋白質衣殼。衣殼由8280個主要的衣殼蛋白p72、P54和P30構成，此外至少有三種蛋白質通過對臨近蛋白的粘連來保持衣殼結構的穩定(Liu etal.2019.Cryo-EM Structure of the African Swine Fever Virus.Cell HostMicrobe26(6):836-843.e3.)

非洲豬瘟病毒在中國《動物病原微生物分類名錄》中歸屬于一類動物病原微生物。目前，只有幾個國家級科研機構可以使用非洲豬瘟病毒進行科研試驗。為了能夠研究和制備用于非洲豬瘟病毒檢測用的單克隆抗體，我們使用分子生物學技術克隆表達P30蛋白，并以此為基礎研究針對P30蛋白的單克隆抗體，但在大規模篩選和評價針對P30蛋白的單克隆抗體時，發現沒有合適的方法和試劑盒，因為常規的方法需要使用非洲豬瘟病毒進行評價。

發明內容

為了彌補現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種不使用非洲豬瘟病毒但可以大規模篩選針對非洲豬瘟病毒特異性蛋白的單克隆抗體篩選方法；優選地的非洲豬瘟病毒蛋白為P30蛋白，優選地方法是建立一種針對非洲豬瘟病毒P30蛋白的ELISA試劑盒。

為了實現本發明的目的，本發明一方面提供了一種非洲豬瘟病毒P30蛋白單克隆抗體鑒定用ELISA試劑盒，所述試劑盒包括抗原包被板、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、羊抗鼠酶標抗體、陽性對照、陰性對照、顯色液、終止液和說明書，其中：所述的抗原包被板為包被有P30蛋白的酶標板；所述的樣品稀釋液為含有1％BSA的1×PBST溶液；所述的濃縮洗滌液為25×PBST溶液，在使用前稀釋到1×PBST溶液；所述的羊抗鼠酶標抗體為使用樣品稀釋液將酶標二抗稀釋10000倍后所得；所述的陽性對照為OD450nm值在0.9～1.2之間的陽性血清；所述的陰性對照為OD450nm值＜0.2的陰性血清；所述的顯色液為TMB單組分顯色液；所述的終止液為2M H₂SO₄。

優選地，本發明所述的抗原包被板上P30蛋白的包被濃度為200ng/孔/100μl。

優選地，本發明所述的陽性對照OD450nm值為1.1。