[發明專利]非洲豬瘟病毒P30蛋白單克隆抗體篩選和檢測用試劑盒及其制備方法

在審

• 申請號: 202010285019.0
• 申請日: 2020-04-15
• 公開（公告）號: CN111474367A
• 公開（公告）日: 2020-07-31
• 發明（設計）人: 孫統威;周晶晶;徐慧珍
• 申請（專利權）人: 杭州恒奧科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;G01N33/569;G01N33/543;G01N33/531
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1.一種非洲豬瘟病毒P30蛋白單克隆抗體鑒定用ELISA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括抗原包被板、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、羊抗鼠酶標抗體、陽性對照、陰性對照、顯色液、終止液和說明書，其中：

所述的抗原包被板為包被有P30蛋白的酶標板；

所述的樣品稀釋液為含有1％BSA的1×PBST溶液；

所述的濃縮洗滌液為25×PBST溶液，在使用前稀釋到1×PBST溶液；

所述的羊抗鼠酶標抗體為使用樣品稀釋液將酶標二抗稀釋10000倍后所得；

所述的陽性對照為OD450nm值在0.9～1.2之間的陽性血清；

所述的陰性對照為OD450nm值＜0.2的陰性血清；

所述的顯色液為TMB單組分顯色液；

所述的終止液為2M H₂SO₄。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的抗原包被板上P30蛋白的包被濃度為200ng/孔/100μl。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照OD450nm值為1.1。

4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的陰性對照OD450nm值為＜0.1。

5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照OD450nm值均≥0.6，陰性對照OD450nm值均＜0.2時，試驗成立，結果有效。

6.一種使用權利要求1所述的試劑盒對待檢樣本進行檢測的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

1)樣本稀釋：用樣品稀釋液將待檢樣本進行1:100倍稀釋；

2)加樣本：加入稀釋好的樣本、陰性對照和陽性對照，其中，陽性對照和陰性對照均做2個重復，100μl/孔，37℃孵育1小時，1×PBST洗滌3次，每孔300μl，每次3分鐘，最后一次拍干；

3)加羊抗鼠酶標抗體：每個反應孔中加入羊抗鼠酶標抗體，100μl/孔，37℃孵育1小時，1×PBST洗滌5次，每孔300μl，每次3分鐘，最后一次拍干；

4)加顯色液：每個反應孔中加100μl顯色液，37℃避光顯色10分鐘；

5)加終止液：每個反應孔中加50μl終止液，并在10分鐘內測定結果。

6)檢測：在酶標儀上測定各孔OD450nm值；

7)試驗有效性判定：當陽性對照OD450nm值均≥0.6，陰性對照OD450nm值均＜0.2時，試驗成立，結果有效；

8)S/P值計算：

9)試驗結果判定：當待檢樣品S/P值≥0.4判為陽性，待檢樣品S/P值＜0.4判為陰性。

7.一種制備如權利要求1所述的試劑盒的方法，其特征在于，所述的方法包括抗原包被板的制備、樣品稀釋液的配制與分裝、濃縮洗滌液的配制與分裝、羊抗鼠酶標抗體的配制與分裝、陽性對照的制備、陰性對照的制備、顯色液的分裝、終止液的配制與分裝。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的抗原包被板的制備包括以下步驟：

1)包被：使用包被緩沖液將純化的非洲豬瘟病毒P30重組蛋白稀釋到2μg/mL，混勻后加入酶標板，100μl/孔，在2～8℃下作用12～15小時；

2)洗滌：用1×PBST洗滌3次，每次3分鐘，每孔300μl，最后一次拍干；

3)封閉：加含1％BSA的PBS，200μl/孔，37℃封閉2小時；

4)洗滌：用1×PBST洗滌3次，每孔300μl，每次3分鐘，拍干；

5)加保護劑：加入10％的海藻糖，37℃孵育2小時，拍干，加干燥劑并抽真空保存。