[發明專利]基于家蠶絲腺表達具有生物學活性的人結締組織生長因子的方法及其產品和應用

在審

• 申請號: 202010283910.0
• 申請日: 2020-04-13
• 公開（公告）號: CN111424035A
• 公開（公告）日: 2020-07-17
• 發明（設計）人: 夏慶友;王峰;王元成;趙萍
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/85;C07K14/475;C07K19/00;A01K67/04;A61K38/18;A61P17/02;A61P17/00
• 代理公司: 重慶航圖知識產權代理事務所(普通合伙) 50247
• 代理人: 王貴君

本發明公開了基于家蠶絲腺表達具有生物學活性的人結締組織生長因子的方法及其產品和應用，具體方法是將編碼人結締組織生長因子基因或N端含透皮肽的人結締組織生長因子基因在家蠶絲腺表達，結繭后繭殼用尿素提取，純化，得到具有生物學活性人結締組織生長因子或N端含透皮肽的人結締組織生長因子；該蛋白具有易于純化，具有促進細胞增殖和透明質酸合成等生物學活性，該研究將加速CTGF作為功能性蛋白質藥物在醫學和醫學美容領域中應用的進程，提供一種利用家蠶或其它生物反應器系統設計和生產高效的蛋白質藥物的新策略。

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及基于家蠶絲腺表達具有生物學活性的人結締組織生長因子的方法，還涉及由該方法制得的產品和應用。

背景技術

人結締組織生長因子，也稱為CTGF或CCN2，是一種富含半胱氨酸的分泌型蛋白質，含有349個氨基酸，分子量為34～38KD。CTGF蛋白由四個保守結構域組成，即胰島素樣生長因子結合結構域、chordin樣半胱氨酸富集結構域、血小板反應蛋白1型結構域和C端胱氨酸結結構域，因此具有多種生物學功能，參與了血管、皮膚、心臟、腎臟、胰腺、肺和肝等多種慢性疾病的組織纖維化過程。例如，促進損傷后肉芽組織的形成、再上皮化以及基質形成和重塑；通過Ras/MEK/ERK MAPK信號通路促進血管生成中的內皮增殖、遷移、存活和粘附以及傷口愈合；增加成纖維細胞和衰老皮膚組織中細胞外基質蛋白的產生(例如I型膠原、纖連蛋白及其整聯蛋白受體)。這些結果表明，CTGF在新組織器官和結構的形成過程中起著重要作用，可以作為功能性藥物用于醫學和醫學美容領域，以幫助受損皮下組織的再生和結構重建，從而迅速恢復其生物學功能。

生物反應器是一種高效、快捷的生產各種有價值的蛋白質藥物的重要方法。該方法可以在短時間內獲得大量的活性靶蛋白藥物，并且具有以下特點：低成本和低工業污染。目前，已經成功開發了大腸桿菌、酵母、中國倉鼠卵巢和其它轉基因植物、昆蟲和動物的多種生物反應器系統，并成功生產了激素、抗體、疫苗、酶和其它多種蛋白質藥物。此前，利用生物反應器的方法也成功生產過CTGF蛋白，例如，大腸桿菌生物反應器系統，該重組CTGF蛋白在I(50)約8pM時顯著抑制血清剝奪誘導的雞胚成纖維細胞凋亡；通過轉染人倉鼠卵巢CTGF基因的cDNA改良的中國倉鼠卵巢細胞生物反應器系統，其生產的38kDa CTGF蛋白被忠實地糖基化并進行了有限的蛋白水解，并在體外以及皮下有效地促進了細胞粘附、有絲分裂和上皮細胞轉分化。

家蠶的蠶腺是一種理想的可以用于構建生物反應器的組織器官，因為在家蠶幼蟲五齡末期該器官能夠大量合成蠶絲蛋白。目前，基于家蠶絲腺已成功開發了多種生物反應器系統，包括家蠶后部絲腺FibL表達系統、Fhx表達系統和FibH表達系統，這些系統將靶標蛋白表達于絲纖維的內部絲素層；家蠶前中部絲腺Ser1表達系統和Ser3表達系統，這些系統將靶標蛋白表達于絲纖維的外部絲膠層。因為位于絲纖維外部絲膠層的靶標蛋白易于分離和純化，因此，家蠶中部絲腺生物反應器得到了快速地發展與優化，目前最優的家蠶中部絲腺表達系統由一個在家蠶神經系統與眼部特異性表達紅色熒光蛋白的3xp3-DsRed-SV40轉錄調控單元、一個來自家蠶核型多角體病毒的Hr3增強子、一個來源于家蠶內源絲膠蛋白1基因的Ser1-P啟動子和Ser1PA終止子組成。迄今為止，該系統已經成功地生產了包括人酸性成纖維細胞生長因子、人堿性成纖維細胞生長因子、人血小板衍生生長因子、人乳鐵蛋白和人轉化生長因子在內的多種蛋白質藥物，并且它們均具有生物學活性。