[發明專利]小鼠腎透明細胞癌循環腫瘤細胞系和人源性腎透明細胞癌循環腫瘤細胞的分離與培養方法

有效

• 申請號: 202010280911.X
• 申請日: 2020-04-10
• 公開（公告）號: CN111321120B
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發明（設計）人: 王振龍;李剛;管栩冰;種鐵
• 申請（專利權）人: 西安交通大學醫學院第二附屬醫院
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 西安合創非凡知識產權代理事務所(普通合伙) 61248
• 代理人: 居延娟

1.一種人源性腎透明細胞癌循環腫瘤細胞的分離與培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：用病毒感染人源性腎透明細胞癌細胞系786-O，使其穩轉綠色熒光蛋白和具有Puromycin抗性，并對該人源性腎透明細胞癌細胞系786-O進行培養；

S2：將步驟S1中培養獲得的人源性腎透明細胞癌細胞系786-O接種于小鼠腋下以獲得腫瘤塊；

S3：將步驟S2中的腫瘤塊接種于另一只健康小鼠的腎下極并進行飼養；

S4：采集步驟S3中小鼠外周血并進行培養、分離得到循環腫瘤細胞；具體地，將經過紅細胞裂解液處理所得細胞重懸于含20ng/mL上皮生長因子EGF，20ng/mL堿性纖維生長因子FGF2，B27添加劑及1%抗生素的1640培養基中，種于低吸附96孔板，于37℃，5%CO₂，4%O₂低氧培養箱中培養；

6天后轉移至正常氧濃度培養箱中使用含3ug/mL Puromycin，10%FBS的1640培養基于24孔板中繼續培養，每2天更換新鮮培養基并清除漂浮死亡細胞，即可得到貼壁生長的循環腫瘤細胞。

2.根據權利要求1所述人源性腎透明細胞癌循環腫瘤細胞的分離與培養方法，其特征在于，所述用病毒感染人源性腎透明細胞癌細胞系786-O的具體過程為：將人源性腎透明細胞癌細胞系786-O培養至細胞匯合度為20-30%時加入9μL病毒EF1A-MCS-P2A-EGFR-SV40-firefly-Luc-IRES-Puromycin以及20ul Polybrene。

3.根據權利要求1所述人源性腎透明細胞癌循環腫瘤細胞的分離與培養方法，其特征在于，步驟S1對人源性腎透明細胞癌細胞系786-O培養時的培養基為：含3 μg/mLPuromycin，10%FBS的培養基。

4.根據權利要求1所述人源性腎透明細胞癌循環腫瘤細胞的分離與培養方法，其特征在于，步驟S4中，小鼠外周血的處理方法為：加入6倍于外周血體積的紅細胞裂解液，于冰上裂解2分鐘。

5.根據權利要求1所述人源性腎透明細胞癌循環腫瘤細胞的分離與培養方法，其特征在于，步驟S4中對小鼠外周血進行培養、分離得到循環腫瘤細胞的過程還包括在正常氧濃度培養箱中，待貼壁腎癌循環腫瘤細胞融合度為90%時進行傳代。

6.根據權利要求1所述人源性腎透明細胞癌循環腫瘤細胞的分離與培養方法，其特征在于，還包括對得到的循環腫瘤細胞的凍存和復蘇過程，具體步驟為：

凍存：將循環腫瘤細胞以凍存液重懸后置于4℃預冷的程序降溫盒中，放置于-80℃過夜，后移至液氮中保存；

復蘇：將液氮中的細胞拿出迅速在39℃的水浴鍋中融化，期間晃動凍存管，整個過程控制在3分鐘內，隨后以10倍體積的培養基重懸融化的細胞，800g離心5分鐘，棄上清，使用新鮮培養基重懸。

7.根據權利要求1所述人源性腎透明細胞癌循環腫瘤細胞的分離與培養方法，其特征在于，所述小鼠為SPF級NOD/SCID小鼠。