[發明專利]小鼠腎透明細胞癌循環腫瘤細胞系和人源性腎透明細胞癌循環腫瘤細胞的分離與培養方法

有效

• 申請號: 202010280911.X
• 申請日: 2020-04-10
• 公開（公告）號: CN111321120B
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發明（設計）人: 王振龍;李剛;管栩冰;種鐵
• 申請（專利權）人: 西安交通大學醫學院第二附屬醫院
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 西安合創非凡知識產權代理事務所(普通合伙) 61248
• 代理人: 居延娟

本發明公開了一種小鼠腎透明細胞癌循環腫瘤細胞系和腎透明細胞癌循環腫瘤細胞的分離與培養方法，涉及腫瘤細胞的分離與培養技術領域；所述小鼠腎透明細胞癌循環腫瘤細胞系為原位腎癌NOD/SCID小鼠的循環腫瘤細胞；所述環腫瘤細胞的分離與培養方法主要包括以下步驟：首先用病毒感染人源性腎透明細胞癌細胞系786?O，使其穩轉綠色熒光蛋白和具有Puromycin抗性，并對該細胞系進行培養；再建立小鼠模型，采集小鼠外周血并進行培養、分離得到腎癌循環腫瘤細胞。本發明的分離與培養方法簡單易操作，分離獲得的循環腫瘤細胞可以進行正常的傳單培養，可以廣泛應用于臨床研究。

技術領域

本發明涉及腫瘤細胞的分離與培養技術領域，具體涉及一種小鼠腎透明細胞癌循環腫瘤細胞系和人源性腎透明細胞癌循環腫瘤細胞的分離和培養方法。

背景技術

腎細胞癌（RCC）是腎臟中最常見的惡性腫瘤，20%-30%的病人在治療后會復發，且有極高的可能因腫瘤而死。惡性腫瘤細胞在癌癥早期便可由原發灶脫落進入血液循環中，利用循環系統到達遠端器官進入休眠狀態或形成轉移灶。循環腫瘤細胞（CTC）是癌癥患者外周血中播散性的腫瘤細胞，其從原發性腫瘤或轉移部位脫落到外周血中，可作為液體活檢，用于早期診斷，風險評估和治療監測。已有大量研究表明，病人外周血中CTC的數量以及分型，與病人預后密切相關。CTC在癌癥的轉移及治療中有重大意義，CTC的分離和體外培養是CTC基礎研究的重中之重。目前為止，尚未見到腎癌循環腫瘤細胞分離培養方法的報道。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供一種小鼠腎透明細胞癌循環腫瘤細胞系和人源性腎透明細胞癌循環腫瘤細胞的分離和培養方法。

本發明的一種小鼠腎透明細胞癌循環腫瘤細胞系為原位腎癌NOD/SCID鼠的循環腫瘤細胞。

本發明的一種人源性腎透明細胞癌循環腫瘤細胞的分離與培養方法，包括以下步驟：

S1：用病毒感染人源性腎透明細胞癌細胞系786-O，使其穩轉綠色熒光蛋白和具有Puromycin抗性，并對該人源性腎透明細胞癌細胞系786-O進行培養；

S2：將步驟S1中培養獲得的人源性腎透明細胞癌細胞系786-O接種于小鼠腋下以獲得腫瘤塊；

S3：將步驟S2中的腫瘤塊接種于另一只健康小鼠的腎下極并進行飼養；

S4：采集步驟S3中小鼠外周血并進行培養、分離得到循環腫瘤細胞。

進一步地，所述使用慢性病毒感染人源性腎透明細胞癌細胞系786-O的具體過程為：將人源性腎透明細胞癌細胞系786-O培養至細胞匯合度為20-30%時加入9ul慢病毒EF1A-MCS-P2A-EGFR-SV40-firefly-Luc-IRES-Puromycin以及20ul Polybrene。

更進一步地，對所述被病毒感染后的人源性腎透明細胞癌細胞系786-O培養的培養基為：含3ug/ml Puromycin，10%FBS的培養基。

更進一步地，所述步驟S4中小鼠外周血的處理方法為：加入6倍于外周血體積的紅細胞裂解液，于冰上裂解2分鐘。

更進一步地，步驟S4中對小鼠外周血進行培養、分離得到循環腫瘤細胞的具體過程為：

S7：將經過紅細胞裂解液處理所得細胞重懸于含20ng/ml上皮生長因子EGF，20ng/ml堿性纖維生長因子FGF2，B27添加劑及1%抗生素的1640培養基中，種于低吸附96孔板，于37℃，5%CO₂，4%O₂低氧培養箱中培養；

S8:6天后轉移至正常氧濃度培養箱使用含3ug/ml Puromycin，10%FBS的1640培養基于24孔板中繼續培養，每2天更換新鮮培養基并清除漂浮死亡細胞，即可得到貼壁生長的循環腫瘤細胞。