[發明專利]一種人羊膜間充質干細胞來源的細胞外囊泡及其應用

有效

• 申請號: 202010269310.9
• 申請日: 2020-04-08
• 公開（公告）號: CN111394305B
• 公開（公告）日: 2022-03-11
• 發明（設計）人: 靳建亮;謝春鳳;朱劍云;苗登順;王嶸;于珍珍;孫海建;陳海云;周佳雯
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/073;A61K35/50;A61P9/00
• 代理公司: 南京業騰知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32321
• 代理人: 李靜

本發明涉及一種人羊膜間充質干細胞來源的細胞外囊泡，制備方法為：分離培養獲得人羊膜間充質干細胞后，培養并進行傳代擴增，培養第3?5代人羊膜間充質干細胞，密度達到70％?80％時棄去培養基，用PBS洗滌后換用含5％無細胞外囊泡的胎牛血清的α?MEM(不含酚紅)培養液，繼續培養48h后收集細胞培養上清，最后通過梯度及高速離心制備得到細胞外囊泡。該細胞外囊泡可通過攜帶的miRNAs21?5p/128?3p/221?3p，直接靶向結合肥大的心肌細胞內的PIK3R1 mRNA的3’?UTR區，抑制PI3K/Akt通路，因此可用于制備防治病理性心肌細胞肥大藥物。

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種人羊膜間充質干細胞(hAMSCs)來源的細胞外囊泡及其應用。

背景技術

病理性心肌細胞肥大(pathological cardiomyocytes hypertrophy,PCH)主要由衰老及神經體液失調控(如血管緊張素II升高)所引起，是多種心血管疾病(如高血壓、心肌梗塞、缺血性心臟病等)的共同過程，被認為是引起心力衰竭和死亡的重要獨立危險因素，防治PCH對治療多種心血管病癥有著重要的意義。傳統的藥物和干預措施僅可部分改善臨床癥狀，探索新的臨床治療方法和策略從而抑制甚至逆轉病理性心肌細胞肥大逐漸成為心血管領域研究的重要方向。

人羊膜間充質干細胞(humanamniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)由產后被“廢棄”的羊膜組織中獲取，具有取材方便、來源廣泛且無倫理學爭議、低免疫原性、有較強的多分化潛能等優勢，是治療心血管疾病理想的一種間充質干細胞。研究發現：間充質干細胞(MSCs)的移植治療作用中的80％是通過其旁分泌作用實現的。旁分泌物質被稱為干細胞釋放分子組，包括蛋白質，microRNA(miRNA)，生長因子和抗氧化劑等，發揮免疫調節，促進血管發生，抗氧化和抗凋亡，促進組織再生修復等作用。作為旁分泌的主要方式，MSCs來源的細胞外囊泡(Extracellularvesicles,EVs)具有與MSCs相似的生物學效應，而且易于提取、改造，比干細胞移植致瘤的風險低，在損傷修復治療中具有重要意義。細胞分泌的EVs中包含miRNA，這些miRNA可被運送至受體細胞并通過改變靶基因的表達調控受體細胞的功能。EVs主要包括了微囊泡及外泌體，細胞在受到物理化學刺激后，胞吞形成早期胞內體，隨著與高爾基體和內質網的相互作用，胞膜內發生內陷，形成多囊泡體，多囊泡體與細胞膜融合后再通過胞吐作用，將多囊泡體中的囊泡釋放到胞外而形成了直徑不同的微囊泡(100-2000nm)或外泌體(40-100nm)。

相關的現有技術有：公開號為CN106635976A的中國發明專利公開了獲得羊膜間充質干細胞的方法及試劑盒，公開號為CN104488850A的中國發明專利公開了一種制備人羊膜間充質干細胞外泌體凍干粉的方法，但是目前尚無關于hAMSCs來源的細胞外囊泡及其在制備防治病理性心肌細胞肥大藥物中的應用方面的報道。

發明內容

本發明的目的在于解決現有技術的不足，提供一種人羊膜間充質干細胞來源的細胞外囊泡及其在制備防治病理性心肌細胞肥大藥物中的應用，其中所述細胞外囊泡制劑源自人羊膜間充質干細胞，主要包含了miRNAs21-5p/128-3p/221-3p，可以通過細胞間傳遞的方式將miRNAs傳遞至肥大的心肌細胞，直接靶向結合肥大的心肌細胞內的PIK3R1mRNA的3’-UTR區，抑制PI3K/Akt通路，防治病理性心肌細胞肥大。

技術方案

一種人羊膜間充質干細胞來源的細胞外囊泡，直徑為40-300nm，所述細胞外囊泡的制備方法包括如下步驟：

(1)分離培養獲得人羊膜間充質干細胞后，培養并進行傳代擴增，用含15％胎牛血清的α-MEM完全培養基培養第3-5代人羊膜間充質干細胞，密度達到70％-80％時，棄去培養基，使用PBS洗滌細胞3-5次，換用含5％無細胞外囊泡的胎牛血清的α-MEM(不含酚紅)培養液，繼續培養48h后，收集細胞培養上清；