[發明專利]一種人羊膜間充質干細胞來源的細胞外囊泡及其應用

有效

• 申請號: 202010269310.9
• 申請日: 2020-04-08
• 公開（公告）號: CN111394305B
• 公開（公告）日: 2022-03-11
• 發明（設計）人: 靳建亮;謝春鳳;朱劍云;苗登順;王嶸;于珍珍;孫海建;陳海云;周佳雯
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/073;A61K35/50;A61P9/00
• 代理公司: 南京業騰知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32321
• 代理人: 李靜

1.一種人羊膜間充質干細胞來源的細胞外囊泡的制備方法，其特征在于，所述細胞外囊泡的直徑為40-300nm，所述細胞外囊泡的制備方法包括如下步驟：

（1）分離培養獲得人羊膜間充質干細胞后，培養并進行傳代擴增，用含15%胎牛血清的α-MEM完全培養基培養第3-5代人羊膜間充質干細胞，密度達到70%-80%時，棄去培養基，使用PBS洗滌細胞3-5次，換用含5%無細胞外囊泡的胎牛血清的α-MEM培養液，繼續培養48h后，收集細胞培養上清；

（2）取10ml細胞培養上清，梯度離心后取上清，通過0.22mm孔徑濾器過濾去除細胞碎片，以100000g的轉速4℃離心100-150min，得到的沉淀即為細胞外囊泡；

步驟（1）中，所述無細胞外囊泡的胎牛血清的制備方法：將Gibco胎牛血清以100000-120000g 的轉速4℃離心12h后，分為3層，輕輕吸取最上層透明層，即為無細胞外囊泡的胎牛血清；

步驟（1）中，所述人羊膜間充質干細胞的分離培養方法包括如下步驟：

1）使用含雙倍青鏈霉素的PBS緩沖液反復沖洗羊膜組織，然后將羊膜組織剪碎，按羊膜組織: 消化液=1:（1-2）的體積比加入消化液，37℃孵育7-10min，得到消化后的羊膜組織；所述消化液為含有2.4U/ml 蛋白酶的1x磷酸鹽緩沖液；

2）將消化后的羊膜組織加入到含有10%胎牛血清的α-MEM完全培養基中，室溫靜置5-10min后，按羊膜組織:消化液=1:（2-3）的體積比將羊膜組織放入消化液中，37℃下消化，得到消化后的組織液；所述消化液為含有0.75mg/ml膠原酶和5% 胎牛血清的a-MEM完全培養基；

3）將消化后的組織液離心，去上清，留沉淀，反復用PBS沖洗、離心，沉淀，直至上清清澈為止，棄去上清，用含15%胎牛血清的α-MEM完全培養基重懸沉淀，獲得貼壁的細胞克隆，快速擴增成為紡錘樣細胞，即為原代人羊膜間充質干細胞。

2.如權利要求1所述的人羊膜間充質干細胞來源的細胞外囊泡，其特征在于，步驟（2）中，所述梯度離心為：先以300g轉速4℃離心10min，再以2000g轉速 4℃離心10min分鐘，最后以10000g轉速4℃離心30min。

3.權利要求1或2所述方法制備的人羊膜間充質干細胞來源的細胞外囊泡在制備防治病理性心肌細胞肥大藥物中的應用。

4.一種藥物，其特征在于，其唯一活性成分為權利要求1或2所述方法制備的人羊膜間充質干細胞來源的細胞外囊泡，所述藥物用于防治病理性心肌細胞肥大。

5.如權利要求4所述的藥物，其特征在于，所述藥物還包含藥學上可接受的載體。

6.如權利要求5所述的藥物，其特征在于，所述藥學上可接受的載體為稀釋劑和賦形劑。

7.如權利要求4或5或6所述的藥物，其特征在于，所述藥物劑型為針劑或凍干粉。