[發明專利]用于快速檢測犬瘟熱病毒的引物組、熒光可視化RT-LAMP試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202010264904.0
• 申請日: 2020-04-07
• 公開（公告）號: CN111254226A
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 王林;張啟龍;孫丹;吳迪;高曉龍;栗云鵬;程汝佳;韋海濤;宋彥軍;周德剛;劉曉冬
• 申請（專利權）人: 北京市動物疫病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京智為時代知識產權代理事務所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺;楊靜

1.一組用于快速檢測犬瘟熱病毒的引物組，其特征在于，其包括：

外引物F3：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

外引物B3：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

內引物FIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

內引物BIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

環引物LF：核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

環引物LB：核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.權利要求1所述的引物組在制備檢測犬瘟熱病毒的RT-LAMP試劑盒中的應用。

3.一種用于快速檢測犬瘟熱病毒的熒光可視化RT-LAMP試劑盒，，其特征在于，其包括如權利要求1中所述的外引物F3、外引物B3、內引物FIP、內引物BIP、環引物LF、環引物LB、熒光目視檢測劑、含有Bst DNA聚合酶和逆轉錄酶的酶反應液。

4.根據權利要求3所述的熒光可視化RT-LAMP試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括2×反應緩沖液。

5.根據權利要求3所述的熒光可視化RT-LAMP試劑盒，其特征在于，所述試劑盒10×Thermopol buffer、50mmol/L MgSO₄溶液、5.0mmol/L甜菜堿溶液和10mmol/L dNTPs。

6.根據權利要求3-5中任一項所述的熒光可視化RT-LAMP試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陽性質控標準品和陰性質控標準品，所述陽性質控標準品為含有犬瘟熱病毒N基因的重組質粒，所述犬瘟熱病毒N基因的序列如SEQ ID NO.7所示，陰性質控標準品為無RNA酶蒸餾水。

7.一種用于檢測犬瘟熱病毒的方法，其特征在于，其包括如下步驟：

S1、從樣品中提取RNA；

S2、對步驟S1提取的所述RNA進行等溫擴增；其中，在反應體系中，采用如權利要求要求1所述的引物組，置于63℃恒溫反應；

S3、結果判定：60分鐘內呈現綠色為陽性，60分鐘內呈現橘黃色為陰性。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，在步驟S2中，所述反應體系包括：

18μL的RT-LAMP預混液：2×反應緩沖液12.5μL、5μmol/L的外引物F3 1μL、5μmol/L的外引物B3 1μL、40μmol/L的內引物FIP 1μL、40μmol/L的內引物BIP 1μL、20μmol/L的環引物LF0.75μL、20μmol/L的環引物LB 0.75μL；

酶溶液1μL；

熒光目視檢測試劑1μL；

和樣品RNA 5μL。

9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，在步驟S2中，所述反應體系包括：

17μL的RT-LAMP預混液：10×Thermopol buffer 2.5μL、50mmol/L MgSO₄ 3.5μL溶液、5.0mmol/L甜菜堿溶液2.5μL、10mmol/L dNTPs 3μL、5μmol/L的外引物F3 1μL、5μmol/L的外引物B3 1μL、40μmol/L的內引物FIP 1μL、40μmol/L的內引物BIP 1μL、20μmol/L的環引物LF0.75μL、20μmol/L的環引物LB 0.75μL；

8.0U/μL的Bst DNA聚合酶0.8μL和10U/μL AMV逆轉錄酶0.2μL；

10mmol/L MnCl₂溶液1.5μL、1.0mmol/L的鈣黃綠素溶液0.5μL；

和樣品RNA 5μL。

10.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，在步驟S2中，設置陽性質控和陰性質控進行檢測，其中，所述陽性質控為含有犬瘟熱病毒N基因的質粒，所述犬瘟熱病毒N基因的序列如SEQ ID NO.7所示，所述陰性質控為無RNA酶蒸餾水。