[發(fā)明專利]用于快速檢測犬瘟熱病毒的引物組、熒光可視化RT-LAMP試劑盒及方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010264904.0
• 申請(qǐng)日: 2020-04-07
• 公開（公告）號(hào): CN111254226A
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王林;張啟龍;孫丹;吳迪;高曉龍;栗云鵬;程汝佳;韋海濤;宋彥軍;周德剛;劉曉冬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京智為時(shí)代知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺;楊靜

本發(fā)明公開了用于快速檢測犬瘟熱病毒的引物組、熒光可視化RT?LAMP試劑盒及方法。本發(fā)明的試劑盒中包含了針對(duì)犬瘟熱病毒設(shè)計(jì)的引物組合，所述引物組合中包含了一對(duì)外引物、一對(duì)內(nèi)引物和兩條環(huán)引物。利用本發(fā)明制備的RT?LAMP試劑盒可實(shí)現(xiàn)對(duì)犬瘟熱病毒的高靈敏度和高特異性檢測，檢測靈敏度為10copies，同時(shí)檢測方法操作簡便，成本較低，設(shè)備適用范圍廣，可用于現(xiàn)場快速檢測核酸，及時(shí)篩查，檢測結(jié)果可肉眼直接觀察，不需進(jìn)行電泳，熒光檢測LAMP即可獲知檢測結(jié)果。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于快速檢測犬瘟熱病毒的引物組、熒光可視化RT-LAMP試劑盒及方法。

背景技術(shù)

犬瘟熱(canine distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)引起犬的一種高度接觸性傳染病，傳染性強(qiáng)，死亡率可高達(dá)80％以上，病犬以典型的雙相熱、上呼吸道、肺及胃腸道卡他性炎癥，非化膿性腦膜-脊髓炎為特征。CDV屬于副黏病毒科麻疹病毒屬，基因組為不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA，主要編碼囊膜相關(guān)的蛋白(M)，兩個(gè)糖蛋白(血凝素H和融合蛋白F)，兩個(gè)轉(zhuǎn)錄酶相關(guān)的蛋白質(zhì)(磷蛋白質(zhì)P和大蛋白L)和核衣殼蛋白(N)。N基因序列保守性高，是CDV的主要抗原基因。

傳統(tǒng)的犬瘟熱檢測方法主要包括膠體金免疫學(xué)診斷方法和分子生物學(xué)診斷方法。目前常用免疫學(xué)診斷方法是膠體金試紙檢測方法。膠體金試紙?jiān)诿舾行院吞禺愋苑矫媲芳眩€存在易受環(huán)境影響，一直未形成相應(yīng)的診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。常用分子生物學(xué)診斷方法有常規(guī)PCR和熒光定量PCR等。RT-PCR和Real-time RT-PCR雖然較之以往方法具有特異性更強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，且自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，但是對(duì)于操作人員的分子生物學(xué)技術(shù)背景要求很高，試劑成本很貴，特定儀器要求高，難以在基層實(shí)際生產(chǎn)中普及應(yīng)用。臨床動(dòng)物醫(yī)院或養(yǎng)殖戶急需高效快速診斷的技術(shù)來滿足臨床快速診斷。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，能在等溫(60～65℃)條件下，短時(shí)間(通常是一小時(shí)內(nèi))內(nèi)進(jìn)行大量的核酸擴(kuò)增，是一種“簡便、快速、精確、低價(jià)”的基因擴(kuò)增方法。與常規(guī)PCR相比，該方法不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，具有簡單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)；在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標(biāo)上也能媲美甚至優(yōu)于PCR技術(shù)，且該方法不依賴任何專門的儀器設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，檢測成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR。

LAMP的特征是針對(duì)靶基因上的六個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)四條引物，利用鏈置換型DNA聚合酶在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，可在15～60分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)10⁹～10¹⁰倍的擴(kuò)增，反應(yīng)能產(chǎn)生大量的擴(kuò)增產(chǎn)物即焦磷酸鎂白色沉淀，可以通過肉眼觀察白色沉淀的有無來判斷靶基因是否存在。LAMP方法的優(yōu)勢(shì)除了高特異性和高靈敏度外，操作還十分的簡單，在應(yīng)用階段對(duì)儀器的要求低，一個(gè)簡單的恒溫裝置就能實(shí)現(xiàn)反應(yīng)，結(jié)果檢測也非常簡單，直接肉眼觀察白色沉淀或者綠色熒光即可，不像普通PCR方法需要進(jìn)行凝膠電泳觀察結(jié)果，是一種適合現(xiàn)場、基層快速檢測的方法。熒光可視化快速檢測犬瘟熱病毒的RT-LAMP試劑盒是在LAMP技術(shù)的基礎(chǔ)上添加了熒光，無需后續(xù)的電泳檢測，直接在儀器上檢測熒光或者肉眼判定，提高了檢測的靈敏度。

雖然目前有一些研究者針對(duì)犬瘟熱病毒開發(fā)了基于LAMP的檢測方法，但上述方法中依然存在著檢測靈敏度相對(duì)較低、易產(chǎn)生假陽性，嚴(yán)重制約著在它們?cè)趯?shí)際檢測中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述問題，本發(fā)明的目的是提供一組用于快速檢測犬瘟熱病毒的引物組，并制備具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、熒光可視化的RT-LAMP試劑盒，用于犬瘟熱病毒的快速、精確地檢測。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一組用于快速檢測犬瘟熱病毒的引物組，其包括一對(duì)特異性外引物，一對(duì)特異性內(nèi)引物和一條環(huán)引物，其核苷酸序列分別為：