[發明專利]一種改進的胃癌冷凍組織開放染色質檢測方法

在審

• 申請號: 202010260336.7
• 申請日: 2020-04-03
• 公開（公告）號: CN111705111A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 鄭曉斌;姜昊;陳海洋;馮宇亮;馮通;揭敏文
• 申請（專利權）人: 蘇州睿邁英基因檢測科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6886
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 趙崇楊

本發明公開了一種改進的胃癌冷凍組織樣品的開放染色質檢測方法，把胃癌冷凍組織加入Stable buffer中研磨，將重懸后的樣品過70μm濾膜，再次研磨，過40μm濾膜收集濾液離心，加入Stable buffer混勻，隨后加入不同濃度的碘克沙醇溶液梯度離心，得到含細胞核的濾液；然后加入Restable Buffer?Tween稀釋，對濾液中的細胞核進行計數，挑取50,000細胞核，離心并去除上清，向沉淀中加入轉座體系，進行轉座反應；然后對已轉座的DNA進行純化，再進行PCR擴增，最后將PCR產物純化后測序。所述方法能有效對臨床胃癌冷凍組織進行染色質結構檢測，該方法可結合患者的臨床數據，從而建立基于染色質結構檢測與患者預后的模型，對于促進精準醫療的發展，具有重要的意義。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地，涉及一種改進的胃癌冷凍組織開放染色質檢測方法。

背景技術

在人類細胞細胞中，DNA與多種蛋白結合形成具有多層結構的染色質。然而，只有1％的染色質是活躍的，被稱為活躍染色質(開放染色質)。這些活躍染色質((如啟動子，增強子)的打開和關閉，以及它們在細胞核中的位置與基因的表達調控和細胞的生物學行為有密切關系。

一直以來，研究者利用DNase I酶切和高通量測序方法(DNase-Seq)揭示活躍染色質在基因組中的線性位置。但是這種方法需要10⁷級別數量以上的細胞以及大量的時間投入，限制了其在臨床活檢中的應用。2013年底斯坦福大學Greenleaf教授和Howard Chang報道的ATAC-seq(Assay for transposase-accessible chromatin using sequencing)技術的出現突破這一限制，為研究染色質的可接近性提供了全新的手段(ATAC-seq通過Tn5轉座酶將測序的adapters插入到基因組上的“可接近”區域來標記調控的區域，僅需500～50000個細胞就能獲得高質量的染色質開放結構圖譜并隨著測序深度的加深(達200millionsreads)，甚至可以直接看到轉錄因子的結合位點(有轉錄因子結合的地方不被Tn5酶切割，形成印跡(footprint)，大大簡化了實驗流程及樣本損耗。2017年7月12日，ATAC-seq技術發明者之一Howard Chang通過追蹤患者在組蛋白脫乙酰酶抑制劑(HDACi)抗癌藥物治療過程中各個時間點的表觀遺傳狀態，首次在時間尺度上深入研究表觀遺傳基因組和關鍵性轉錄因子對患者藥物敏感性的動態調控機制，并準確預測患者對HDACi抗癌藥物的敏感性，為新的靶向治療方案提供依據，也為研究其他疾病的精準醫療的表觀遺傳調控機制建立模板。另外，通過ATAC-seq數據對正常、混合、宿主、腫瘤細胞的DNA拷貝數進行分析，利用人類染色體圖顯示人類基因組DNA的拷貝數在各細胞類型中的差異，Howard Chang證實了在混合和腫瘤細胞中多個已被報道的遺傳變異，如chr4q、chr8q和chr17q的增加，chr10q和chr17p的缺失等，并發現這些變異并沒有發生在正常人或者患者的宿主細胞中。有趣的是，HowardChang發現遺傳層面的DNA拷貝數差異并不能反映患者對藥物的敏感性，相反，表觀遺傳層面的轉錄因子調控機制卻可以準確的預測患者對藥物的應答情況，再一次說明對患者表觀遺傳基因組研究的重要性，也提示了當前精準醫療研究中常規使用的基因測序的局限性。同時，這些鑒定出的轉錄因子可以很好的區分正常人和處于不同癌癥階段的病人，基于這一點，可以將正常人與癌癥病人、不同階段癌癥病人特異的轉錄因子核酸序列設計成為基因芯片上的靶核苷酸探針來檢測病人是否患有癌癥或位于癌癥的哪個階段，這些新的特異探針也大大拓展了現有的一些經典的檢測探針，使得基因芯片的結果更具準確性。

遺憾的是，經典的ATAC-seq技術只能在新鮮細胞中進行Tn5的轉座實驗，否則文庫的質量極差。因此嚴重限制了ATAC-seq在臨床樣本檢測中的應用。專利CN 108300774A公開了一種針對冰凍組織的ATAC-seq方法，但是將所述方法用于胃癌冷凍組織的ATAC-seq研究時，構建的文庫質量依然較差。因此，需要針對胃癌提供一種改進的胃癌冷凍組織開放染色質檢測方法。

發明內容