[發明專利]一種改進的胃癌冷凍組織開放染色質檢測方法

在審

• 申請號: 202010260336.7
• 申請日: 2020-04-03
• 公開（公告）號: CN111705111A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 鄭曉斌;姜昊;陳海洋;馮宇亮;馮通;揭敏文
• 申請（專利權）人: 蘇州睿邁英基因檢測科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6886
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 趙崇楊

1.一種改進的胃癌冷凍組織開放染色質檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1.將胃癌冷凍組織加入Stable buffer中研磨，將重懸后的樣品過70μm濾膜，再次研磨，過40μm濾膜收集濾液，離心去上清，加入Stable buffer混勻，隨后分別按順序加入不同濃度50％、30％、40％碘克沙醇溶液梯度離心，得到含細胞核的濾液；所述Sable buffer包含以下終濃度的各組分：5mM CaCl₂，3mM Mg(Ac)₂，10mM Tris pH7.8，0.1mM EDTA，0.10％NP40，320mM蔗糖，0.02mM PMSF蛋白酶抑制劑，0.2mMβ-巰基乙醇；

S2.取步驟S1含細胞核的濾液，加入Restable Buffer-Tween稀釋，然后對濾液中的細胞核進行計數，挑取50,000細胞核，離心去上清，向沉淀中加入轉座體系，進行轉座反應；然后對已轉座的DNA進行純化，再進行PCR擴增，最后將PCR產物純化后進行測序；所述Restable Buffer-Tween包含以下終濃度的各組分：10mM Tris-HCl pH 7.4，10mM NaCl，3mM MgCl₂，0.10％Tween 20。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1所述胃癌冷凍組織與Stablebuffer的質量體積比為10～20mg：1～2mL。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1所述梯度離心溶液為先加入50％碘克沙醇溶液，重懸混勻，使終濃度為25％，再將30％碘克沙醇溶液加至25％的溶液層之下，最后將40％碘克沙醇溶液加至30％的溶液層之下，離心。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S2所述含細胞核的濾液與RestableBuffer-Tween的體積比為2：5～6。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S2所述轉座體系為25μL TD buffer，2.5μL DDW，2.5μL TDE1，16.5μL PBS，0.5μL 1％digitonin，0.5μL 10％Tween-20。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S2所述轉座反應為1000rpm，37℃，30min。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S2所述對已轉座的DNA進行純化為用AMPure beads進行純化：向已轉座的DNA中加入AMpure beads，混勻后靜置，再置于磁分離架上靜置分離，然后去除上清并用80％乙醇溶液洗滌，重復該步驟，去除殘留的乙醇溶液，最后用EB溶液或DDW洗脫。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S2所述PCR產物純化為用AMPurebeads進行純化：向PCR反應產物中加入終濃度為0.65×的AMpure beads，混勻后靜置，再置于磁分離架上靜置分離，將上清液轉到新管中，加入終濃度為1.8×的AMpure beads，混勻后靜置，再置于磁分離架上靜置分離，然后去除上清并用80％乙醇溶液洗滌，重復該步驟，去除殘留的乙醇溶液，最后用EB溶液或DDW洗脫。

9.權利要求1～8任一項所述方法在胃癌冷凍組織開放染色質檢測中的應用。

10.一種用于胃癌冷凍組織開放染色質檢測的產品，其特征在于，包含權利要求1中所述的Stable buffer，不同濃度碘克沙醇溶液及Restable Buffer-Tween。