[發(fā)明專利]一種乳桿菌GM_1及其選育方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010255998.5 | 申請日： | 2020-04-02 |
| 公開（公告）號： | CN111647521A | 公開（公告）日： | 2020-09-11 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 陳忠洪;陳華維;曾憲為 | 申請（專利權(quán)）人： | 玉林市容縣奇昌種豬養(yǎng)殖有限公司 |
| 主分類號： | C12N1/20 | 分類號： | C12N1/20;C12N15/01;C12N1/04;C12R1/225 |
| 代理公司： | 北京國坤專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11491 | 代理人： | 趙紅霞 |
| 地址： | 537500 廣西*** | 國省代碼： | 廣西;45 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 桿菌 gm_1 及其 選育 方法 | ||
1.一種乳桿菌GM_1的選育方法，其特征在于，所述乳桿菌GM_1的選育方法包括以下步驟：
步驟一，菌株活化培養(yǎng)：將待選育的乳桿菌菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，并在溫度37℃與有氧的條件下暗中活化培養(yǎng)24h，傳代培養(yǎng)3代后，將得到的培養(yǎng)液劃線接種于MRS平板培養(yǎng)基上，并置于溫度37℃的條件下培養(yǎng)48h；
步驟二，從MRS平板培養(yǎng)基上挑選一個單菌落作為出發(fā)菌株，并接種于5ml MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃靜置培養(yǎng)24～48h，傳代培養(yǎng)3代；再按3％的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃靜置培養(yǎng)24～36h得活化的菌液，凍干保藏；
步驟三，制備接種液：將步驟二得到的乳桿菌單菌落置于5～8mL的生理鹽水中混合均勻得到乳桿菌懸液；用LSM培養(yǎng)液稀釋菌懸液至在波長600～800nm條件下OD值為0.15～0.2，得到乳桿菌接種液；
步驟四，用無菌離心管中吸取乳桿菌接種液2.5ml，加入亞硝基胍母液和滅菌磷酸緩沖液定容至5.0ml，將離心管置于搖床上，溫度為36.5～37℃混合均勻，5000r/min離心6min，棄去上清液，洗滌，稀釋，得亞硝基胍處理過的菌液；
步驟五，將亞硝基胍處理過的菌液涂布于MRS平板培養(yǎng)基上于37℃培養(yǎng)24h后，挑選單菌落接種于液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)24h，得到乳桿菌突變單體，每個處理的新種質(zhì)一起組成突變?nèi)后w；
步驟六，將步驟五得到的突變單體在MRS平板培養(yǎng)基上劃線，于37℃培養(yǎng)24～36h，挑選出形態(tài)規(guī)則、特征明顯、菌落明顯大于其它菌落的菌落，即可得到新的、快速生長的乳桿菌GM_1；
步驟七，將步驟六選育得到的乳桿菌GM_1接種于MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，進行冷凍離心，得到沉淀；往沉淀中加入凍干保護劑后進行凍干，取出后在無菌環(huán)境下進行粉碎至粉狀，得到選育后的乳桿菌GM_1凍干粉。
2.如權(quán)利要求1所述的乳桿菌GM_1的選育方法，其特征在于，步驟一中，所述MRS液體培養(yǎng)基由20g/L葡萄糖、12g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L無水乙酸鈉、2g/L磷酸氫二鉀、1.5g/L檸檬酸二胺、0.5ml/L吐溫-80、0.25g/L硫酸錳和濃度為0.25～1.0mol/L的KH2PO4緩沖液組成。
3.如權(quán)利要求2所述的乳桿菌GM_1的選育方法，其特征在于，所述MRS液體培養(yǎng)基的制備方法為：
(1)將葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、無水乙酸鈉、磷酸氫二鉀、檸檬酸二胺、吐溫-80、硫酸錳混合；
(2)在混合液中加入KH2PO4緩沖液，定容至1000mL；
(3)用0.1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7；
(4)在120℃條件下滅菌10min，得到MRS液體培養(yǎng)基。
4.如權(quán)利要求1所述的乳桿菌GM_1的選育方法，其特征在于，步驟一中，所述MRS平板培養(yǎng)基是在MRS液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加25.0g/L瓊脂，高壓滅菌20～30min。
5.如權(quán)利要求1所述的乳桿菌GM_1的選育方法，其特征在于，步驟四中，所述稀釋的方法為：棄去上清液后，用滅菌磷酸緩沖液洗滌菌體2～3次后，加入等體積的滅菌磷酸緩沖液懸浮菌體，適當(dāng)稀釋。
6.如權(quán)利要求1所述的乳桿菌GM_1的選育方法，其特征在于，步驟五中，所述乳桿菌突變?nèi)后w添加20％的滅菌甘油，于-80℃長期保存。
7.如權(quán)利要求1所述的乳桿菌GM_1的選育方法，其特征在于，步驟六中，所述在相同培養(yǎng)時間內(nèi)菌落大小是未經(jīng)誘變的菌落大小的2倍以上。
8.如權(quán)利要求1所述的乳桿菌GM_1的選育方法，其特征在于，步驟七中，所述乳桿菌GM_1在37℃的環(huán)境下培養(yǎng)48h后，在4℃、6000rpm的環(huán)境下進行冷凍離心；并于冷凍干燥機里凍干48小時后粉碎。
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