[發明專利]一種快速的沙漠薔薇愈傷組織誘導和規模化懸浮培養方法

有效

• 申請號: 202010254295.0
• 申請日: 2020-04-02
• 公開（公告）號: CN111280063B
• 公開（公告）日: 2023-09-05
• 發明（設計）人: 王鵬;張玉潔;劉水燕;張衛
• 申請（專利權）人: 安賽搏（重慶）生物技術有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京安博達知識產權代理有限公司 11271
• 代理人: 徐國文

1.一種沙漠薔薇愈傷組織誘導和規模化懸浮培養方法，其特征在于按如下的步驟進行：

（1）沙漠薔薇種子消毒：將沙漠薔薇種子用常溫水浸泡10-15min，剝除軟質種皮，立刻置入4%次氯酸鈉溶液消毒8-10min，無菌水洗滌4次，置于基礎培養基BM上，27-29℃培養，光照強度＜1000?lux；所述的基礎培養基BM指的是：1/2MS或MS+?30g/L蔗糖?+?0.1mg/L?Gln+?0.2mg/L?水解乳蛋白，瓊脂0.7-1.0%，pH5.8-6.0；

（2）沙漠薔薇無菌苗培養：將已萌發的沙漠薔薇無菌苗種子在基礎培養基BM中培養至植株高2-3cm，開始快繁，快繁方式為將沙漠薔薇無菌苗去除根部，移入快繁培養基PM，需要7-14d發生側芽，待側芽生長至1.5-2cm切下用于再次快繁或生根，培養過程溫度控制在25℃-32℃，光照強度500-1500?lux；

所述的快繁培養基PM指的是：MS?+?0.1-0.5?mg/L?IAA?+?0.2-0.5?mg/L?6-BA?+?30g/L蔗糖?+?0.1mg/L?Gln?+?0.2mg/L?水解乳蛋白，瓊脂0.7-1.0%，pH5.8-6.0；

（3）沙漠薔薇愈傷組織誘導：將沙漠薔薇的葉片剪成0.5-1cm長的小段，置于愈傷誘導培養基CIM，26-32℃培養，光照強度＜1000?lux，7-14d即在切口邊緣形成白色疏松的愈傷組織；所述的愈傷誘導培養基CIM指的是B5?+?1-2mg/L?2,4-D?+?30g/L蔗糖?+?0.1mg/LGln?+?0.2mg/L?水解乳蛋白，瓊脂0.7-1.0%，pH5.8-6.0；

（4）沙漠薔薇愈傷組織繼代：將誘導獲得的沙漠薔薇愈傷組織分成0.5cm大小的小塊，置于愈傷繼代培養基CM1，26-32℃培養，光照強度＜1000?lux，每7-10d繼代一次；所述的愈傷繼代培養基CM1指的是：B5?+?0.5-1?mg/L?2,4-D?+?30g/L蔗糖?+?0.1mg/L?Gln?+0.2mg/L?水解乳蛋白，瓊脂0.7-1.0%，pH5.8-6.0；

（5）沙漠薔薇愈傷組織懸浮培養：選取質地疏松、顏色白色至淺黃色、生長速度快的沙漠薔薇愈傷組織，按1g/10mL比例接入懸浮培養基CM2，置于搖床100-115?rpm培養，溫度保持26-32℃，按5-15g/100mL比例，濕重，每7-10d繼代一次，生長速度3-4倍/7d；

所述的懸浮培養基CM2指的是：B5?+?0.5-1?mg/L?2,4-D?+?30g/L蔗糖?+?0.1mg/L?Gln+?0.2mg/L?水解乳蛋白，pH5.8-6.0；

（6）沙漠薔薇愈傷組織的一次性生物反應器培養：選取狀態一致的已培養7d的懸浮培養材料，向5L一次性生物反應器中接入1000-1500?mL懸浮培養物和除菌處理的3500-4000mL?懸浮培養基CM2使終體積為5000?mL，振頻為9.5次/min，通空氣為0.1?m3/h，培養7d；繼代時，將培養物接入新的一次性生物反應器，加入2-4倍體積的懸浮培養基CM2，振蕩并通氣培養，振蕩頻率范圍為2-15次/min，通氣量為0.05-0.3?m3/h，培養過程中反應器的振頻為5-20次/min。

2.權利要求1所述的培養方法在快速獲得生長迅速、分散良好的沙漠薔薇懸浮細胞系方面的應用。