[發(fā)明專利]一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的夾心ELISA定量檢測法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010253460.0
• 申請日: 2020-04-02
• 公開（公告）號: CN111443200B
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王乃東;鄒亞文;楊毅;于浩洋;王東亮;湛洋;楊文兵
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南陽銘永康生物科技有限公司;湖南陽銘生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 北京君智知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11305
• 代理人: 鄭明

本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒夾心定量ELISA檢測法及其應(yīng)用。本發(fā)明基于硫酸乙酰肝素(heparan?sulfate，HS)包被板，通過反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了豬圓環(huán)病毒2型(porcine?type?2，PCV2)病毒樣顆粒(VLPs)定量的夾心ELISA方法(PCV2?VLPs?HS?ELISA)。該方法利用PCV2?VLPs作為標準品建立了用于定量的標準曲線，檢測最低濃度約62.5ng/ml，相關(guān)系數(shù)Rsupgt;2/supgt;為0.998，具有操作簡單、定量準確性好、靈敏度高等特點，可用于PCV2?VLPs的夾心ELISA快速定量及組裝效率評價。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒夾心定量ELISA檢測法及其應(yīng)用，屬于動物疾病診斷和生物制品領(lǐng)域。

背景技術(shù)

豬圓環(huán)病毒（Porcine?type?2，PCV2）是一種無囊膜的單鏈環(huán)狀DNA病毒，屬于圓環(huán)病毒科，被認為是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning?multisystemic?wastingsyndrome,?PMWS）、豬皮炎腎病綜合征等的主要病原體，PCV2能損傷豬免疫系統(tǒng)，引起豬嚴重的免疫抑制，常與其他病原體（豬藍耳病毒、豬細小病毒、豬鏈球菌等）多重感染和混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。PCV2呈現(xiàn)全球性分布，PCV2感染豬的典型臨床癥狀為體表皮膚出現(xiàn)丘疹或者不規(guī)則的紅紫斑、精神不振等，在保育豬中，最常見的是呼吸道綜合征，引起生長緩慢、厭食等不良情況。在妊娠期的母豬中，主要引起繁殖性障礙，產(chǎn)生死胎或者流產(chǎn)等情況。在部分臨床案例中，PCV2的感染不產(chǎn)生明顯癥狀。

疫苗是防御PCV2?感染的最有效手段之一，目前市場上銷售的病毒樣顆粒亞單位疫苗主要品牌有勃林格殷翰、普萊柯和武漢中博等，其主要抗原為PCV2?Cap蛋白或基于PCV2?Cap組裝形成的PCV2病毒樣顆粒（virus-like?particles,?VLPs），能夠具有很好的保護效果。然而在VLPs疫苗的生產(chǎn)和質(zhì)量控制過程中，對于有效抗原的定量方式非常重要。目前在對PCV2?VLPs及Cap蛋白的鑒定及定量方式主要包括透射電子顯微鏡、分子篩色譜法、間接免疫熒光、超速離心法和夾心ELISA法等。

目前PCV2夾心ELISA的公開專利（豬圓環(huán)病毒2型雙抗體夾心ELISA試劑盒及其應(yīng)用，申請?zhí)?01811095919.8）以及（識別PCV2病毒樣顆粒的單克隆抗體及其在定性及定量檢測PCV2病毒樣顆粒中的應(yīng)用，申請?zhí)?01811261025.1）中都是基于將制備的鼠源單克隆抗體包被在96孔板中，建立雙抗夾心ELISA方法，這些方法的技術(shù)關(guān)鍵是利用小鼠雜交瘤細胞技術(shù)篩選出合適的鼠源單抗，整個過程技術(shù)要求高、周期長。硫酸乙酰肝素（HeparanSulfate，HS）是PCV2?細胞受體。Misinzo?G.?等報道PCV2或PCV2?VLPs可通過與細胞表面硫酸乙酰肝素（Heparan?sulfate,?HS）或者硫酸軟骨素B（Chondroitin?Sulfate?B,?CS-B）結(jié)合而侵染細胞（Misinzo?G,?Delputte?PL,?Meerts?P,?Lefebvre?DJ,?and?Nauwynck?HJ.Porcine?circovirus?2?uses?heparan?sulfate?and?chondroitin?sulfate?Bglycosaminoglycans?as?receptors?for?its?attachment?to?host?cells.?Journal?ofvirology?2006;80?(7):?3487-3494.）。減少以上受體分子在細胞膜上的分布，將會明顯抑制PCV2?的侵染。因此本發(fā)明將HS包被到96孔板，建立PCV2?VLPs夾心ELISA方法，縮短了新型夾心ELISA方法的研發(fā)周期，此法適用于PCV2?VLPs夾心ELISA快速定量及組裝效率評價。

發(fā)明內(nèi)容